Ⅰ. 서 론

조절마비제란 부교감신경 차단제로 섬모체근을 마비 시켜 조절이 일어나지 않는 확대 된 상태에서 안저 검사 및 굴절검사에 사용되어지는 약물로, 소아 환자와 원시 나 사시가 있는 환자에서 정확한 굴절검사를 위해 조절 마비가 필요하다.¹⁾ 조절마비제로 Cyclogyl^Ⓡ 과 Atropine^Ⓡ 이 사용되고 있으며, Cyclogyl^Ⓡ 은 조절마 비 작용을 하는 Cyclopentolate HCl 1% 와 보존제로 BAC 0.01% 을 함유하고 있으며, Atropine^Ⓡ 은 Atropine Sulfate 1% 와 BAC 0.01% 을 포함하고 있다.

조절마비제 영향이 나이, 조절기능, 홍채의 색소 침 착 정도 등의 영향을 받으며, 나이가 어릴수록, 조절기 능이 클수록, 홍채의 색소 침착이 심할수록 더 강한 농 도와 빈번한 점안이 필요하다고 알려져 있으며,²⁾ 성인 의 조절마비하 굴절검사는 작용시간이 반나절에서 하 루 정도 지속되는 조절마비제들이 사용되고 있다.³⁾ Cyclogyl^Ⓡ 의 농도 및 점안 횟수에는 여러 의견이 있으 나 Duane⁴⁾은 6세 이하의 어린이에서는 2% 의 Cyclogyl^Ⓡ 을 5분 간격으로 3회 점안하는 방법이 필요 하며, 청소년층은 0.5% 또는 1% Cyclogyl^Ⓡ 2회 점안 으로 충분하다고 한다. 이처럼 Cyclogyl^Ⓡ 은 굴절검사 하기에 편리한 약제이고 그 신속성 때문에 주목을 끄는 약제인 것이다. 조절마비제를 사용할 시에 알레르기성 결막염, 눈꺼풀 결막염 등이 나타날 수 있고 안압 증가, 결막과 각막의 색소 침착, 황반부종, 각막 내피세포 손 상, 점적 직후의 작열감과 일시적인 결막 충혈, 눈부 심, 시야 흐림 등의 증상이 나타날 수 있다.^5-6) 이로 인한 결막세포의 손상을 알아보기 위해 결막세포주를 MTT assay 방법으로 세포 생존율과 형태학적 변화를 조사하기 위해 H-E 염색 후 광학현미경으로 관찰하였 고, 세포자연사를 관찰하기 위해 유세포 분석기를 이 용하여 세포 주기를 분석하고자 하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 실험 재료

본 연구에 사용된 세포는 사람의 결막세포인 clone 1-5c-4 세포를 사용하였다. clone 1-5c-4 세포는 한국 세포주 은행(Korean cell line bank, Korea)으로부터 분양 받아 사용하였다. 10% 의 fetal bovine serum (FBS; Cambrex, USA)와 fungizone 및 antibiotics를 함유한 RPMI1640 (Gibco, USA) 배양액을 사용하였다. 조절마비제는 cyclopentolate HCl(10 mg/mℓ)와 BAC(0.1 mg/mℓ)로 조제된 Cyclogyl^Ⓡ (Alcon, USA) 1% 와 Atropine sulfate(10 mg/mℓ)와 BAC(0.1 mg/mℓ)로 조제된 Atropine^Ⓡ (Alcon, USA) 1% 을 사용하였 다. Cyclopentolate HCl과 atropine sulfate, BAC는 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하였다.

2. 세포배양 및 처리

세포 배양은 75 cm²의 배양용 플라스크(NUNC, USA) 에 일정량의 배양액을 넣어 37℃, 5% CO₂로 조정된 CO₂ 항온기(Forma Scientific, USA)에서 배양하였다. 배양 된 세포는 0.25% trypsin–EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)로 부유시킨 후 0.4% trypan-blue로 염색하여 혈구계산기로 세포 수를 산정하였다. 세포 생 존율 실험은 배양된 세포를 96 well plate (Nunc, USA) 에 1×10⁶ cells/well의 세포 부유액을 200 μl씩 분주하 여 24시간 배양한 후 실험에 사용하였다.

96 well plate에 배양된 결막세포주를 Cyclogyl^Ⓡ, cyclopentolate HCl, Atropine^Ⓡ, atropine sulfate 은 1.0%, 0.75%, 0.50%, 0.25% 농도로, BAC는 0.01%, 0.0075%, 0.005%, 0.0025% 농도로 배양액 에 녹인 후 15분 처리 후 phophate buffered saline (1×, pH 7.2)로 헹군 후 새로운 배양액을 넣고 24시 간 추가 배양한 군으로 구분하였다. 대조군은 세포배 양 후 아무것도 처리하지 않았다.

3. 세포 생존율 측정(MTT assay)

MTT assay는 Mosmann 방법에 따라 시행하였다.⁷⁾ MTT( 3-[ 4, 5-dime thyl thi azol -2-yl ] -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide: Sigma, USA) assay는 세포소기관 중 미토콘드리아 효소의 활성도 를 측정하여 세포사 진행과정의 초기 세포의 생존율을 측정하는 방법이다. 세포 배양액을 MTT 200 μg/㎖가 포함된 배양액으로 교환하고 3시간 반응시킨 후 배양 액을 DMSO 200 μl/well로 교체하여 5분간 실온 방치 시켰다. 그런 다음 formazan을 용해시켜 microplate spectrophotometer(Bio-Tech, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.

4. Hematoxylin-Eosin(H-E) 염색 후 광학현미경에 의한 세포 형태 조사

H-E 염색을 위해 세포는 6 well plate에 멸균된 plastic Thermanox^Ⓡ coverslips (NUNC, USA)를 넣 은 후 그 위에 세포를 배양하였다. Cyclogyl^Ⓡ, cyclopentolate HCl, Atropine^Ⓡ, atropine sulfate, BAC를 15분 처리한 후, 처리용액을 제거한 뒤 coverslips만 떼어내었다. 형태학적 관찰을 위해 70% 에탄올에서 10 분 동안 고정한 후 핵과 세포질을 H-E으로 대조 염색하 였다. 염색 후 알코올 과정을 거쳐 탈수시켰으며, 투명 화 과정을 거친 후 canadian balsam (Wako Pure Chemical, Japan)으로 봉입하여 영구표본을 제작하였 다. H-E로 염색된 세포는 광학현미경(×100)하에서 관 찰하여 핵 응축(pyknotic nuclei) 또는 세포예정사 소 체(apoptotic body)로 보이는 세포들을 촬영하였다.

5. 세포주기 분석에 의한 세포자연사 관찰

Cyclogyl^Ⓡ, cyclopentolate HCl, Atropine^Ⓡ, atropine sulfate, BAC를 15분 처리한 후 clone 1-5c-4 세포의 세포주기 분석을 위해 유세포분석기를 이용하여 세포의 핵 내 DNA양을 측정하는 Seifer⁸⁾ 등 의 방법을 이용하였다. Culture dish로부터 수확한 세 포에 hypotonic fluorochrome solution을 첨가하여 4℃에서 6시간 동안 염색하였다. 유세포 분석에 방해 가 되는 세포덩어리를 35 μm nylon mesh로 여과한 후, 아르곤 레이저의 488 nm 파장에서 발기하여 610 nm의 파장으로 여기되는 propidium iodide의 형광성 에 따라 DNA양을 측정하였다.

유세포분석기의 histogram에서 Ao (Go/G1보다 DNA 형광성이 낮은 구역의 세포 군집), Go/G1 (DNA 합성전기), S (DNA 합성기), G2/M (DNA 합성 후 유사 분열기)의 각각의 구역을 얻은 후, 세포분석 프로그램을 이용하여 계산하였다. DNA 검사에 요구되는 정확한 alignment를 위해 calibrated fluorescent bead standard (DNA-CHECK Coulter cytometry, Hialeah, FL)를 이용하여 50% peak height에서 coefficient of variation 값을 1.9% 이하로 유지하였다.

6. 세포 독성 평가

세포 독성의 평가 기준은 호주의 뉴 사우스 웨일즈 (New South Wales) 대학의 부설 Cooperative Research Center for Eye Research and Technology (CRCERT)에서 시행한 세포 독성 염색법을 사용한 잠재 독성 평가 보고서를 기준으로 하여 Cyclogyl^Ⓡ, cyclopentolate HCl, Atropine^Ⓡ, atropine sulfate, BAC는 배양액을 버린 후 배양액과 동일한 양을 15분간 처리하 여 MTT 비색검정으로 대조군에 비해 세포 증식 저해율 이 30% 이상이면 독성이 있는 것으로 판정하였다.

7. 통계학적 분석

통계학적 유의성 검정은 Origin 6.0을 이용하여 one-way ANOVA 방법을 사용했으며, 유의수준 p< 0.05의 범위 내에서 그 결과들은 평균에 대한 표준 편 차로 분석하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 세포 생존에 미치는 영향(MTT assay)

Cyclogyl^Ⓡ, cyclopentolate HCl, Atropine^Ⓡ, atropine sulfate를 농도별(1.0%, 0.75%, 0.50%, 0.25%), BAC를 농도별(0.01%, 0.0075%, 0.005%, 0.0025%), 15분 처리한 후 96 well에 배양한 clone 1-5c-4 cells에 처리하여 대조군과 처리군을 비교한 결과 Cyclogyl^Ⓡ 1% 에서는 대조군 대비 21.3%, 0.75% 에서는 21.7%, 0.50% 에서는 24.6% 로 세포 생존율이 30% 미만으로 나타났으며, 0.25% 에서는 36.3% 의 세 포 생존율을 보였다(Fig. 1). Cyclopentolate HCl 1% 에서는 대조군 대비 20.1%, 0.75% 에서는 23.8%, 0.50% 에서는 59.7%, 0.25% 에서는 85.5% 의 세포 생존율을 보였다(Fig. 1). BAC 0.01% 에서는 대조군 대비 31.2%, 0.0075% 에서는 33.6%, 0.005% 에서는 37.2%, 0.0025% 에서는 58.8% 의 세포 생존율을 보였 다(Fig. 1).

Atropine^Ⓡ 1% 에서는 대조군 대비 24.8% 로 세포 생존율이 30% 미만으로 판명되었고, 0.75% 에서는 31.7%, 0.50% 에서는 40.9%, 0.25% 에서는 60.3%의 세포 생존율을 보였다(Fig. 2). Atropine Sulfate 1% 에서는 대조군 대비 29.3%, 0.75% 에서는 37.9%, 0.50% 에서는 55.8%, 0.25% 에서는 74.1% 의 세포 생존율을 보였다(Fig. 2).

2. H-E 염색 후 광학현미경에 의한 세포 형태 조사

핵과 세포질을 H-E으로 대조 염색해서 형태를 광 학현미경(×100)으로 관찰한 결과, Cyclogyl^Ⓡ 0.25% 와 cyclopentolate HCl 0.25% 처리군에서는 대조군 과 비교해서 세포수가 감소하고 핵의 응축을 관찰할 수 있었고, Cyclogyl^Ⓡ 1% 와 cyclopentolate HCl 1% 처리군에서는 핵의 응축과 핵의 분절이 관찰되었으 며, BAC 0.0025% 처리군에서는 대조군과 비교해서 세포수의 감소와 핵의 응축이 관찰되었고 BAC 0.01% 처리군에서는 세포의 형태가 위축되었고 핵의 분절이 관찰되었다(Fig. 3).

Atropine^Ⓡ 0.25% 와 atropine sulfate 0.25% 처리 군에서는 대조군과 비교해서 세포수가 감소하고 핵의 응축을 관찰할 수 있었고, Atropine^Ⓡ 1% 와 atropine sulfate 1% 처리군에서는 핵의 응축과 핵의 분절이 관 찰되었다(Fig. 4).

3. 세포주기 분석에 의한 세포자연사 관찰

Cyclogyl^Ⓡ, cyclopentolate HCl, Atropine^Ⓡ, atropine sulfate를 농도별(1.0%, 0.75%, 0.50%, 0.25%), BAC를 농도별(0.01%, 0.0075%, 0.005%, 0.0025%)로 배양된 clone 1-5c-4 cells에 15분 처리 한 후에 수확한 세포들의 주기를 분석한 결과, 세포핵 이 propidium iodide에 약하게 염색되어 세포자연사 를 보이는 Ao기의 경우 대조군에서는 7.31% 로 세포 자연사가 거의 일어나지 않았음을 관찰할 수 있었다. Cyclogyl^Ⓡ 를 0.25% 처리 시 Ao기의 세포가 10.84%, 0.5% 에서는 23.68%, 0.75% 에서는 34.44%, 1% 에 서는 52.92% 로 증가하였고, cycolpentolate HCl를 0.25% 처리 시 Ao기의 세포가 4.44%, 0.5%, 0.75%, 1% 에서는 Ao기의 세포가 9.32%, 12.34%, 15.61% 로 증가하는 것으로 나타났고, BAC를 0.0025% 처리 시 Ao기의 세포가 11.12%, 0.005% 와 0.0075% 에서는 각각 13.15% 와 18.03% 로 증가했으며, 0.01% 에서는 19.33% 로 증가함을 관찰할 수 있었다(Fig. 5).

Atropine^Ⓡ 를 0.25% 처리 시 Ao기의 세포가 9.21%, 0.5% 에서는 15.36%, 0.75% 에서는 25.65%, 1% 에서는 31.36% 로 증가하였고, atropine sulfate 를 0.25% 처리 시 Ao기의 세포가 9.77%, 0.5%, 0.75%, 1% 에서는 Ao기의 세포가 10.51%, 13.73%, 14.07% 로 증가함을 관찰할 수 있었다(Fig. 6).

Ⅳ. 고 찰

조절력을 차단시키기 위한 목적으로 사용되는 조 절마비제는 첫째, 검안경을 용이하게 볼 수 있도록 동공을 확대 시키고 둘째, 특히 어린이들의 섬모체근 을 마비시켜 굴절검사를 돕고, 셋째, 포도막염에서 유착을 방지하고 동통과 눈부심을 감소시키기 위해 동공을 확대시키고 섬모체근을 마비시키기 위한 것이 다.⁹⁾

조절마비제 종류에는 작용시간이 긴 atropine sulfate와 작용시간이 짧은 cyclopentolate HCl, tropicamide 등이 있다. Atrpine sulfate는 점안 후 30~40분 사이에 섬모체근 마비를 일으키기 시작하 여 2시간 내에 최대효과를 보이며, 정상안에서 6일에 서 14일 동안 지속되는 조절마비제로 소아에서 조절 마비제로 쓰이는 것 이외에도 홍채염의 치료시 하루 2~3회 국소 점안한다.⁹⁾ Cyclopentolate HCl는 조절 마비가 점안 후 30~60분 이내에 발생하며, 지속시간 은 24시간 미만이며, tropicamide는 최대 조절마비 효과에 도달하는데 걸리는 시간은 20~25분이며, 효 과 작용시간은 15~20분에 불과하므로 검사를 하는 시점이 매우 중요하며 완전히 원상태로 회복되기까지 는 5~6시간이 걸린다.^9-13)

본 연구에서는 Cyclogyl^Ⓡ, cyclopentolate HCl, Atropine^Ⓡ, atropine Sulfate를 농도별(1.0%, 0.75%, 0.50%, 0.25%)와 BAC를 농도별(0.01%, 0.0075%, 0.005%, 0.0025%) 독성을 세포수준에서 MTT assay 방법을 사용하여 세포 생존율을 알아보 고자 시행하였다.

Cyclopentolate HCl 0.25% 와 atropine sulfate 0.25% 에서만 세포 생존율이 70% 를 넘는 것으로 세 포 독성이 없는 것으로 조사되었다. Cyclogyl^Ⓡ 1% 에 서는 세포 생존율이 21.3%, 0.75% 에서는 21.7%, 0.5% 에서는 24.6%, 0.25% 에서는 대조군 대비 36.3% 로 모든 농도에서 독성이 있는 것으로 관찰되 었다. Atropine^Ⓡ 1% 에서는 대조군 대비 24.8% 로 세포 생존율이 30% 미만으로 판명되었고, 0.75% 에 서는 31.7%, 0.50% 에서는 40.9%, 0.25% 에서는 60.3% 의 세포 생존율을 보였다.

대부분의 조절마비제는 보존제로 BAC를 사용하는 데 보존제인 BAC를 첨가하지 않고 성분인 cyclopentolate HCl과 atropine sulfate를 단독으로 처리 했을 경우에 독성이 낮게 나타났다. 이는 BAC에 의 한 독성이 많이 관여한 것으로 사료된다. BAC는 4급 암모늄염으로 보존제, 항균제, 용해보조제, 습윤제로 사용되며 cetrimide와 같은 양이온성 계면활성제처 럼 사용된다. 안과적 질환의 예방 및 치료 목적으로 사용되는 BAC 농도가 0.01~0.02% 정도이며, 안정 성이 좋고 반감기가 길며 Pseudomonas 속의 세균에 효과적으로 작용하나, 외상 후 각막 상피의 재생을 지연시키며, 세포막에 작용하여 이온이나 물질의 투 과성을 변화시키고, 결막이나 세포조직에 작용하여 독성을 초래한다고 보고되고 있다.^14-16) BAC는 Debbasch 등¹⁷⁾과 Seo¹⁸⁾의 결막세포를 이용한 실험에 서 MTT assay를 이용하여 0.01% 로 15분 후 평가한 결과, 세포 생존율이 31.5% 로 조사되었는데 본 연구 에서도 31.2% 의 세포 생존율 보여 유의한 결과를 보 였다. BAC가 함유된 점안제를 사용한 경우 자극감을 호소했고, 눈알의 표면 질환이 있는 환자가 BAC가 포함된 점안제를 장기간 사용해서 각막 내피의 손상 으로 인해 각막이식을 하게 된 사례를 보고한 바도 있다. H-E 염색법으로 세포들을 관찰한 결과 실험한 약물들의 0.25% 농도에서부터 세포수가 감소하기 시 작했고 1% 의 농도에서는 핵의 분절을 관찰할 수 있 었다. 보존제인 BAC에서는 0.0025% 에서 세포수가 감소하기 시작했고 제품에 포함되어 있는 농도인 0.01% 에서는 세포수가 감소하고 세포핵의 분절을 관찰할 수 있었다.

세포자연사는 유전적으로 프로그램된 세포사멸의 과정으로 정상세포의 생리학적, 발생학적, 면역학적 과정에 중요한 역할을 한다. 각막에서도 세포자연사 가 각막의 구조를 유지하는데 중요한 역할을 하는 것 으로 알려지고 있다. 탈락과 재생을 반복하는 상피 세포에서 비정상적인 세포사멸이 일어나면 실질에 영 향을 미치게 되어 각막의 구조에 변화가 올 수 있다. 유세포분석기에 의해 세포 주기의 분석 결과 A₀기는 세포자연사에 의해 propidium iodide에 대한 세포 핵의 약한 염색성을 보이는 시기인데 높을수록 세포 자연사가 많음을 나타낸다. 대조군에서는 A₀기 수치 가 7.31% 를 나타냈는데 Cyclogyl^Ⓡ 1% 에서는 A₀기 수치가 52.92% 를 나타냈고 Atropine^Ⓡ 1% 에서는 A₀기 수치가 31.36% 로 이 수치는 대조군과 비교해 볼 때 세포자연사가 관찰되었다.

점안마취제인 Alcaine^Ⓡ 는 마취제 성분인 proparacaine hydrochloride (PPC)와 0.01% BAC를 함 유하고 있고 세포독성에 대한 epigallocatechingallate (EGCG)의 보호효과를 알아본 결과 점안마취 제인 PPC에 EGCG를 전 처리함으로 세포생존율이 증 가시키고, 유도된 세포자연사를 억제시켜 EGCG는 세 포보호 효과가 있는 것으로 나타났다.¹⁸⁾ Park 등¹⁹⁾의 연구에서는 EGCG의 보호효과를 알아보기 위해 EGCG 를 농도별로 전 처리한 결과 EGCG의 처리 농도가 높을 수록 세포 생존율이 증가하였고, H₂O₂의 단독 처리군 인 58% 의 생존율을 비교했을 때, H₂O₂로 유도된 세포 손상에 대하여 보호효과를 나타냈다. 조절마비제의 세 포 생존율을 높이기 위해서는 천연보존제로서의 EGCG 활용을 해볼 필요가 있다고 생각되어진다.

Cyclogyl^Ⓡ 과 Atropine^Ⓡ 의 조절마비제로 주로 사 용되는 1% 농도 경우에는 세포 생존율이 30% 넘지 않는 것으로 나타나 장기간의 사용은 각막과 결막세 포에 손상을 줄 것으로 검사시 투여할 때는 올바른 점안방법과 부작용을 충분히 숙지시킨 후 점안하여 검사하고, 추후 세포 생존율을 높이기 위해서는 천연 보존제 활용도의 후속 연구가 필요하다고 사료된다.