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ISSN : 1229-6457(Print)
ISSN : 2466-040X(Online)

The Korean Journal of Vision Science Vol.18 No.1 pp.89-97
DOI : https://doi.org/10.17337/JMBI.2016.18.1.89

gyrA and parC Gene Analysis of the Quinolone Antimicrobial Susceptibility-decreased Serratia marcescens Strains Isolated from Contact Lens Case

Hun-Taek Na, Maeng-Sig Joung, ·Hong-Seon Kim

Dept. of ocular optics, Gangneung Yeongdong College, Gangneung

E-mall : nht0227@naver.com

Address reprint requests to Hun-Taek Na Dept. of ocular optics, Gangneung Yeongdong College, Gangneung
Tel : 010-3903-0227

Received January 23, 2016 Review February 21, 2016 Accepted March 11, 2016

Abstract

Purpose:

For Serratia marcescens strains appeared to quinolone antibiotic susceptibility-decrease used in the treatment of bacterial keratitis by analyzing the main target gyrA and parC genes involved in resistance mechanisms and to investigate the cause of the susceptibility decrease.

Methods:

By extracting genomic DNA targets of quinolone antimicrobial susceptibility-decreased Serratia marcescens strains after amplification by PCR and analyzed by DNA sequencing of the gyrA and parC gene QRDR.

Results:

In the parC gene analysis, SM5 strain showed double amino acid mutations (Tyr51→His, Thr59→Asp), SM6 strain showed (Thr59→Asp), SM13 strain showed single amino acid mutation (Tyr51→His). And 3 strains showed many silent mutations in gyrA and parC gene.

Conclusions:

It could be confirmed that the antimicrobial susceptibility caused by mutations in target gene is lowered, especially parC gene was confirmed the major target causes sensitivity degradation of quinolone antibacterial agents. We will continue the use of quinolone antimicrobial in the treatment of bacterial keratitis, many resistant strains are predicted would occur. Therefore, when using the antimicrobial is always careful to be necessary in resistant.

Key Words : Contact Lens , quinolone , Serratia marcescens , parC

콘택트렌즈 케이스에서 분리한 퀴놀론계 항균제 감수성 저하 Serratia marcescens 균주의 gyrA와 parC 유전자 분석

나훈택,정맹식,김홍선

강릉영동대학교 안경광학과, 강릉

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Cited-By

Funding:

Ⅰ. 서 론

콘택트렌즈의 부작용으로 인한 세균성 각막염의 치료에 사용되는 여러 가지의 약제가 있지만 그중에 서 퀴놀론계 항균제가 일차 치료제로 주로 사용되고 있다.¹⁾ 특히 점안용 퀴놀론계 항균제는 1990년대에 도입된 이후부터 안과의 감염성 질환 치료 및 수술 전 예방적 처리를 위해 널리 사용되고 있다.²⁾ 장점으 로는 낮은 안구 독성, 좋은 각막 투과성, 실온에서의 안정성이며, 또한 그람양성균과 그람음성균을 모두 억제할 수 있는 광범위 항균제라는 것이다.^3-4)

퀴놀론계 항균제는 세균의 DNA 합성에 필요한 효 소인 DNA gyrAse(topoisomerase Ⅱ)와 topoisomerase Ⅳ의 작용을 억제하여, DNA의 supercoil 구 조를 이완하는 작용과 DNA 이중나선구조를 푸는 작 용도 못하게 되고, 결국 DNA의 복제가 정지되며 세 균이 죽게 되는 항균 작용기전을 나타낸다. DNA gyrAse는 DNA 복제를 위하여 DNA의 supercoil 구 조를 풀어주는 역할을 담당하며, gyrA와 gyrB 유전 자에 의해 encoding되고, Topoisomerase Ⅳ는 parC 와 parE 유전자에 의해 각각 encoding 된다.^5-6) 임 상에서는 세균성 각막염이 의심되면 대부분 배양검사 결과 없이 일차 치료제로 퀴놀론계 광범위 항균제를 사용하고 있는 실정이며,^1,7-8) 따라서 내성의 증가를 초래한다고 보고되고 있다.⁹⁾ 근래에는 항균제의 내성 문제가 전 세계적인 공중보건 문제로 많이 대두되고 있는 실정이다.¹⁰⁾

세균성 각막염의 일차 치료제인 퀴놀론계 항균제 는 3가지의 내성기전으로 나누어진다. 먼저 이 약제 의 표적 부위인 DNA gyrAse(gyrA, gyrB)와 topoisomerase Ⅳ(parC, parE) 유전자, 즉 염색체에 위치한 퀴놀론 저항성 결정 부위 QRDR(Quinolone resistance determining region)의 아미노산 변이에 의한 내성이 주요 기전으로 알려져 있으며,¹¹⁾ 특히 gyrA와 parC 유전자의 QRDR에 변이가 많이 나타난 다고 보고되었다.¹²⁾ 두 번째 내성기전으로는 세포막 단백질인 porin의 구조 변화 또는 능동적 약물 유출 펌프(active efflux pump)에 의한 기전으로 AcrABTolC efflux pump의 과발현으로 인한 유출이 증가하 여 세포 내에 항균제의 축적을 억제시켜 내성을 유발 한다고 알려져 있다.^13-14) 그리고 마지막 내성기전으 로는 plasmid를 매개로 하여 퀴놀론 항균제의 내성 유전자(plasmid mediated quinolone resistance, PMQR)를 획득하여 내성을 나타낸다고 알려져 있으 며, 특히 장내세균에서 PMQR에 의한 내성을 나타내 는 세균의 비율이 급속히 증가하고 있는 추세에 있다 고 한다.¹⁵⁾ 플라스미드에 위치한 내성에 관여하는 유 전자로는 qnr 그룹에 속하는 qnrA, qnrB, qnrS이며 퀴놀론으로부터 DNA gyrAse와 topoisomerase IV를 보호하여 내성을 증가시킨다.¹⁶⁾ 또한 항균제의 변형 에 관여하는 aac(6')-lb-cr와 active efflux pump 유전자인 qepA 등^17,15)이 알려져 있으며, 플라스미드 를 이용하여 수평 전이를 가능하게 한다.

본 연구에서는 이전연구¹⁸⁾에서 16S rRNA gene 염 기서열 분석을 통해 동정된 콘택트렌즈 케이스에서 분리한 Serratia marcescens 균주들 중에 세균성 각 막염의 일차 치료제인 퀴놀론계 항균제의 감수성 저 하 균주(SM5, SM6, SM¹³⁾를 대상으로 (Table 1) 내 성기전에 관여하는 이 약제의 표적 부위 gyrA와 parC 유전자 QRDR의 DNA sequencing을 분석하여 퀴놀론계 항균제 감수성 저하의 원인을 파악하고자 한다.

Ⅱ. 대상 및 방법

1. Genomic DNA 추출 및 primer 제작

균주분리는 멸균된 면봉으로 콘택트렌즈 케이스를 각각 문지른 후 Luria-Bertani agar media(Difco Inc., U.S.A)에 Streaking하여 24시간 동안 37℃ 배 양기에서 배양한 colony를 picking하여 Luria- Bertani broth(Difco Inc., U.S.A) 3ml가 들어있는 conical tube에 접종하여 회전 배양기에서 37℃, 250rpm의 조건으로 24시간 동안 배양하여 균주를 순 수 분리하였다. 그리고 순수 분리된 균주를 16S rRNA gene sequencing 방법으로 동정 및 항균제 감수성 검 사를 실시하였다. 그중에 퀴놀론계 항균제 감수성 저 하 균주를 대상으로 Puregene Yeast/Bact. kit B(Qiagen Inc., U.S.A.)를 사용하여 genomic DNA 를 추출하고 gyrA-F, gyrA-R과 parC-F, parC-R primer를 사용하여 PCR를 통해 증폭하였다.

그리고 DNA sequencing 분석을 위한 primer를 Table 2에 정리하여 나타내었다. primer 제작은 gyrA와 parC 유전자 서열에 대하여 상보적인 짧은 단선의 염기서열로 Macrogen Inc.에서 100 pM scale로 합성하였다. 합성한 primer는 3차 멸균 증류 수로 최종 10pM로 희석하여 –20℃에 보관하면서 실 험에 사용하였다.

2. PCR(Polymerase Chain Reaction) 및 DNA 정제

PCR 반응 용액은 Genomic DNA 50ng(1㎕), 2X Blue PreMix-HF Taq(Macrogen Inc., Korea) 10㎕, Forward primer, Reverse primer 1㎕씩 첨가하여 최종 20㎕가 되도록 멸균된 3차 증류수를 PCR 튜브에 넣어 주었다. 각각의 PCR 반응 조건은 Table 3과 같 다. 증폭된 산물은 1.2% agarose gel(Seakem LE,. Bioproducts Inc., U.S.A.)에서 135V/cm로 25분간 전기영동으로 확인하였다. 그리고 PCR 정제는 Plus PCR purification kit(NucleoGen Inc., Korea)를 사 용하였다. 먼저 PCR 반응 용액의 5배 용량의 PCR purification buffer를 첨가한 후 column에 옮겨 담 고 vacuum으로 DNA를 걸러주었다. 그리고 750㎕의 wash A buffer를 column에 넣고 vacuum으로 세척 한 후 알코올 성분이 날아가도록 상온에서 2분간 13000rpm으로 원심 분리하였다. 마지막으로 elution buffer 40㎕를 넣고 1분간 정치한 후 1분간 13000rpm 으로 원심 분리하여 DNA를 정제하였다.

3. DNA sequencing

증폭된 gyrA와 parC 유전자는 Macrogen Inc.에서 sequencing을 분석하였다. gyrA와 parC 유전자의 sequencing 분석에는 BioEdit(Sequence Aligenment Editor, Brown lab) program과 NCBI program 을 이용하여 분석하였다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

gyrA와 parC의 primer를 사용한 PCR 증폭 결과 gyrA와 parC 유전자에서 300bp 크기의 각각의 DNA 단편들을 얻을 수 있었다. PCR 생산물을 전기 영동한 결과는 Fig. 1에 나타냈다. 이전 연구¹⁸⁾의 항균제 감수성 검사의 결과에서(Table 1) 다른 균주들에 비해 억제 대 지름이 적게 나타난 3 균주(SM5, SM6, SM13)에 대해서 gyrA gene의 염기서열을 분석한 결과 S. marcescens (SM5) 균주에서는 wild type과 비교해서 nucleotide sequence 237번 G → A, 279번 T → C, 315번 T → C로 mutation이 일어났다. 아미노산 비교에서는 codon 79 부위 proline CCG(Pro) → CCA(Pro), codon 93 부위 Alanine GCT(Ala) → GCC(Ala), codon 105 부위 Glycine GGT(Gly) → GGC(Gly)으로 아미노산 변이는 나타나지 않았고, silent mutation만 관찰되었다. 한편 S. marcescens(SM6), S. marcescens(SM13) 두 균주 의 gyrA 유전자의 QRDR에 대한 염기서열의 변화는 나 타나지 않았다(Fig. 2, 3. Table 4, 5).

parC gene의 염기서열을 분석한 결과 S. marcescens(SM5) 균주에서는 wild type과 비교해서 nucleotide sequence 151번 T → C, 165번 A → G, 176번 C → A, 207번 C → T, 297번 T → C, 333번 C → G, 357번 C → T로 mutation이 일어났다. 아미노산 의 비교에서는 codon 51 부위 Tyrosine(TAC) → Histidine(CAC), codon 59부위 Threonine(ACC)→ asparagine(AAC)으로 아미노산 이중 변이가 관찰되었 으며, Glu55(GAA → GAG), Arg69(CGC → CGT), Tyr99(TAT → TAC), Gly111(GGC → GGG), Phe119 (TTC → TTT) 부위에서는 silent mutation이 관찰되었 다. S. marcescens(SM6) 균주에서는 nucleotide sequence 165번 A → G, 176번 C → A, 274번 C → T, 297번 T → C, 327번 G → T, 333번 C → G, 357번 C → T로 mutation이 일어났으며, 아미노산 비교에서는 codon 59 부위 Threonine(ACC)→ asparagine(AAC) 으로 아미노산 단일 변이가 관찰되었고, Glu55(GAA → GAG), Leu92(CTG → TTG), Tyr99(TAT → TAC), Gly108(GGG → GGT), Gly111(GGC → GGG), Phe119 (TTC → TTT) 부위에는 silent mutation이 관찰되었다. 그리고 S. marcescens(SM13) 균주에서는 nucleotide sequence 151번 T → C, 198번 A → G, 223번 C → T, 234번 C → T, 333번 C → T로 mutation이 일어났고, 아미노산 비교에서는 codon 51 부위 Tyrosine(TAC)→ Histidine(CAC)으로 아미노산 단일 변이가 관찰되었으 며, Lys66(AAA → AAG), Leu75(CTG → TTG), Tyr78(TAC → TAT), Gly111(GGC → GGT) 부위에는 silent mutation이 관찰되었다(Fig. 4, 5. Table 4, 5).

한편 Yang HF 등¹⁹⁾ 연구에서는 Serratia marcescens 균주의 gyrA 유전자 QRDR codon 83 부위에 서 Ser83(TCG) → Leu(TTG), codon 87 부위에서 Asp87(GAC) → Asn(AAC) 변이가 나타났으며, parC 유전자 QRDR codon 80 부위에서는 Ser80(AGC) → Ile(ATC) 아미노산 변이로 인하여 내성을 유발한다고 보고되었다. 또한 Kim JH 등²⁰⁾ 연구에서는 본 연구 에서와 같이 gyrA 유전자 QRDR 부위에서 Pro79 (CCG) → Pro(CCA)와 Gly105(GGT) → Gly(GGC)으 로 silent mutation이 관찰되었다고 보고되었다.

본 연구에서도 Serratia marcescens 균주 중 1개 균주는 parC 유전자 QRDR의 이중 변이로, 2개의 균 주는 단일 변이로 아미노산이 변이된 균주임을 확인 할 수 있었으며, 또한 gyrA와 parC 유전자에 다수의 잠재 돌연변이도 함께 관찰되었다. S. marcescens처 럼 gram negative 균주에서는 parC 유전자에 의해 encoding되는 topoisomerase Ⅳ보다 gyrA 유전자 에 의해 encoding되는 DNA gyrAse의 작용이 주요 작용으로 알려져 있는데, 본 연구에서는 parC 유전자 의 변이가 더 많이 내성기전에 관여된 것으로 관찰되 었다. 다시 말해 parC 유전자의 아미노산 변이로 인 한 퀴놀론계 항균제에 대한 감수성 저하가 나타나고 있음을 확인할 수 있었다. 한편 콘택트렌즈에서 분리 한 Serratia marcescens 균주에 대한 퀴놀론계 항균 제 내성기전의 국내 보고는 아직까지 없었으며, 본 연구에서도 내성 균주는 아니지만 항균제의 억제 대 지름 범위가 다른 균주에 비해 적게 나타나 감수성이 저하된다고 판단되는 균주들을 대상으로 실험하여 왜 감수성이 저하되고 있는지 원인을 파악하고자 하였 다. 또한 앞으로 Serratia marcescens 뿐만 아니라 콘택트렌즈의 부작용과 밀접한 관련이 있는 대표적인 그람양성균인 Staphylococcus aureus와 그람음성균 인 Pseudomonas aeruginosa 등 다양한 세균들에 대해서도 세균성 각막염 치료에 일차적으로 쓰이는 만큼 퀴놀론계 항균제의 내성기전에 관한 연구가 많 이 이루어져야 할 것으로 생각된다.

Ⅳ. 결 론

콘택트렌즈 케이스에서 분리한 Serratia marcescens 균주들 중에서 다른 균주들에 비해 감수성이 저 하된 Serratia marcescens 3 균주에 대하여 퀴놀론 항균제의 주요 내성기전으로 이 약제의 표적 부위인 gyrA와 parC 유전자의 QRDR를 분석한 결과 parC 유 전자의 codon 51부위에서 Tyrosine → Histidine으 로, codon 59부위에서 Threonine → asparagine으 로 아미노산 변이가 나타났다. 또한 3 균주 모두 gyrA 와 parC 유전자에서 다수의 silent mutation이 관찰 되었다. 따라서 parC 유전자의 아미노산의 변이로 인 한 퀴놀론계 항균제의 감수성이 저하되고 있다는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 Serratia marcescens 균주 에 대한 parC 유전자가 항균제의 감수성을 저하시키 는 표적임을 다시 한 번 확인할 수 있었다. 앞으로도 세균성 각막염 치료에 퀴놀론계 항균제의 사용이 계속 될 것이며, 많은 내성 균주들이 발생할 거라 예측된 다. 따라서 항균제를 사용할 때 내성에 대한 주의가 반드시 필요할 것으로 사료된다.

Figure

Fig. 1.

Agarose gel electrophoresis of the PCR product (300 bp) amplified of gyrA and parC gene. M, 100 bp ladder maker, Lane 1, SM5 gyrA and parC gene; Lane 2, SM6 gyrA and parC gene; Lane 3, SM13 gyrA and parC gene.

Fig. 2.

Comparison of nucleotide sequences in QRDR of gyrA gene.

Fig. 3.

Comparison of amino acids in QRDR of gyrA gene.

Fig. 4.

Comparison of nucleotide sequences in QRDR of parC gene.

Fig. 5.

Comparison of amino acids in QRDR of parC gene.

Table

Table 1.

Quinolone Antibiotic Susceptibility Test of Serratia marcescens.

Table 2.

Primer used in PCR Amplification and Sequencing.

Table 3.

Reaction conditions for PCR amplification.

Table 4.

Nucleotide sequence mutation in QRDR of gyrA and parC gene.

Table 5.

Amino acid substitutions in QRDR of gyrA and parC genes.

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