Ⅰ.서 론
콘택트렌즈의 착용에 매우 중요한 요소인 눈물은 염분, 칼슘, 지방, 점액, 단백질 등의 성분으로 구성 되어 있다1). 이 중 albumin, globulin, lysozyme은 눈물 속의 100여 개의 단백질 중 대부분을 차지하고 있다2).
globulin은 면역복합체를 형성하고 세균을 용해하 며 독소 또는 바이러스를 중화시킨다3). 내부적으로 결합력이 강한 lysozyme은 콘택트렌즈 표면에 강하 게 흡착되며, 콘택트렌즈 침전물에서 발견되는 전체 단백질량의 약 40%를 차지하고 있다4). 이러한 눈물 속의 단백질은 콘택트렌즈 표면에 부착하여 착용감 및 콘택트렌즈 사용 기간에 영향을 줄 수 있다고 알 려져 있다5).
이와 같은 단백질의 흡착을 보완하기 위한 노력으 로 친수성 고분자인 하이드로겔의 코팅, 친수성-소 수성 마이크로상 분리를 갖는 표면 설계6), 콘택트렌 즈 표면에 PEG의 코팅7), p(HEMA) hydrogel과 다당 류와의 상호 침투 고분자 구조(inter penetrating polymer network: IPN)8-9) 등이 연구되어 왔다.
상호 침투 고분자 구조(inter penetrating polymer network: IPN)는 고분자를 혼합하는 고분자 블렌드 (polymer blend)의 한 형태로써 두 가지 이상의 고분자 의 가교로 이루어진 혼합물로 정의된다. 이는 하나의 네트워크 구조에 속한 고분자 사슬이 물리적으로 다른 네트워크와 서로 얽혀 있어 각 네트워크 구조를 형성하 고 있는 화학결합을 제거하기 전에는 각 네트워크 구조 의 분리가 어려운 고분자 혼합구조이다. 이러한 상호 침투 고분자 구조는 고분자의 개별 특성을 결합하여 각 각의 장점을 모두 나타내는 새로운 특성을 가진다.
따라서 기존의 하이드로겔 콘택트렌즈가 가지는 장점과 가교된 물질의 장점을 모두 가질 수 있으므로 새로운 콘택트렌즈의 제조 방법으로 주목받고 있으 며, IPN 구조의 기본 물질로 키토산과 히알루론산과 같은 다당류가 이용되고 있다.
여러 가지의 다당류 중에서 키토산의 경우 글루코사 민(glucosamine)과 N-아세틸 글루코사민(N-acetyl glucosamine)으로 구성되어 있으며 생분해성, 무독성 및 생체 적합성으로 인해 상처 치료용 드레싱, 항응혈 제, 약물 전달 체계 등의 생물 의학 응용 분야에서 널리 응용되고 있다. 또한, 키토산은 친수성에 도움을 주는 히드록시기(-OH)를 다량 함유하고 있으며, 다른 작용 기와 쉽게 결합할 수 있는 친핵성의 아민기(-NH2)를 가지고 있어 여러 가지 생체 의학적 응용에 유용하게 사용되어 진다10).
그러나 키토산은 물과 유기용매에는 불용성이고 pH 3 이하의 산성용액에서만 가용성이기 때문에 콘 택트렌즈에 적용될 수 있는 가교반응이 매우 제한적 이다. 키토산을 이용한 가교결합은 사실상 IPN이 유 일한 제조 방법이다. 이때 가교반응에서 사용되는 글 루타르알데히드(glutaraldehyde) 및 에피클로로히드 린(epichlorhydrin)과 같은 가교제는 독성이 있으므 로, 키토산을 이용한 IPN구조 역시 생물･의학 분야에 서의 사용에 제한을 받기도 한다.
하지만 카복실기(-COOH)와 아민기(-NH2)를 동시 에 가지고 있는 석시닐-키토산의 경우 중성 수용액 에서도 쉽게 용해되어 분자 간 혹은 분자 내 아마이 드결합을 통해 추가적인 가교제의 사용 없이 상호 침 투 고분자 구조를 형성할 수 있어 p(HEMA) 네트워 크와의 결합을 통해 IPN 구조의 빌딩 블록으로 사용 이 가능하다.
본 실험에서는 석시닐-키토산과 p(HEMA) 하이드 로겔을 상호침투가교(inter penetrating polymer network: IPN)방법으로 콘택트렌즈를 제조 후 물성 및 단백질 흡착 특성을 확인하였다.
Ⅱ.재료 및 방법
1.시약 및 재료
하이드로겔 콘택트렌즈의 제조를 위해 HEMA(2- Hydroxyethyl methacrylate, 96%, Junsei), EGDMA (ethylene glycol dimethacrylate, 98%, Aldrich), AIBN(azobis isobutyronitrile, 98%, Junsei), NVP (N-vinyl pyrrolidone, 99%, Junsei)를 사용하였다.
석시닐-키토산과 p(HEMA) 하이드로겔의 가교에 사 용된 cross linker로 EDC(N-(3-dimethylaminopropyl) -N'-ethyl carbodiimide, 97%, Aldrich), NHS(Nhydroxysuccinimide, 98%, Aldrich)를 사용하였다.
그 외 Chitosan(100-300 kDa, 600-800 kDa)은 Acros 시약을 사용하였다
2.기기 및 분석
광 투과율의 측정은 GENOVA NANO (Bibby Scientific, UK)을 사용하였다. 접촉각의 측정은 DSA 100 (Krüss)을 사용하여 습윤성을 평가하였고, 함수율 은 gravimetric method를 사용하여 측정하였다. 콘택 트렌즈 표면의 거칠기를 평가하기 위해 AFM(NX10, Park systems) 을 사용하였으며, 추출한 단백질의 정 량을 위한 흡광도는 Microplate Readers(ELX800, BioTek Instruments, USA)를 사용하여 측정하였다.
3.석시닐-키토산 가교 콘택트렌즈 제조
1)석시닐-키토산(Succinyl-chitosan) 합성11)
가지 달린 플라스크에 chitosan 1g, 증류수 76mL, acetic acid(4mL)를 넣고 교반 한 다음 MeOH (320mL)로 희석하였다. 여기에 succinic anhydride (3g)을 넣어 준 후 24시간 실온에서 교반하였다. Scheme. 1-2
이후 pH를 6.1로 맞춘 후 거름종이를 이용하여 거 른 후 삼각플라스크에 증류수 100mL와 함께 넣어 4 0℃에서 교반시키면서 녹여내었다. 이후 3일간 동결 건조 하여 카복실기가 결합한 Succinyl-chitosan을 합성하였다.
chitosan은 100-300 kDa과 600-800 kDa으로 각각 실험하였다.
2)키토산 침투 콘택트렌즈 제조
동결 건조한 Succinyl-chitosan(0.1g)과 증류수 (10g)를 바이알에 넣어 1Wt % Succinyl-chitosan 수용액을 만든 후 비커에 옮겨 건조 상태의 콘택트렌 즈(Table 1)를 2일 동안 침지 하여 콘택트렌즈 내부 로 Succinyl-chitosan 수용액이 골고루 침투할 수 있도록 하였다.
동결 건조한 Succinyl-chitosan은 100-300 kDa 과 600-800 kDa으로 각각 실험하였다.
3)석시닐-키토산 상호침투가교 콘택트렌즈 제조
Succinyl chitosan(100-300 kDa, 600-800 kDa)이 침투되어 있는 렌즈를 N-(3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide(28.5mg, 0.15mmol), Nhydroxysuccinimide( 17mg, 0.15mmol), PBS(9g)를 넣어 Ph를 6.1로 맞춘 다음 Succinyl-chitosan이 침투되 어 있는 콘택트렌즈를 침지 후 24시간 동안 가교 시켜 키토산 가교 콘택트렌즈를 제조하였으며, 키토산의 분자 량에 따라 IPN-S(100-300 kDa), IPN-L(600-800 kDa)로 명명하였다.
4.단백질 흡착특성 비교
1)인공눈물제조
석시닐-키토산 가교 하이드로겔 콘택트렌즈의 단 백질 흡착 특성을 알아보기 위해 인공 눈물을 Table 2와 같이 제조하였다.
인공눈물 제조에 사용된 단백질은 lysozyme(chicken egg lysozyme, 90%, Aldrich), albumin(bovine serum albumin, 96%, Aldrich), globulin(bovine blood globulin, 99%, Aldrich)을 사용하였다12).
2)단백질 흡착
콘택트렌즈가 충분히 침지 될 수 있도록 3mL의 인공 눈물을 넣어준 후 shaking incubator(37℃, 150rpm) 에서 24시간 동안 흡착시켰다. Scheme. 3
실험에 사용된 콘택트렌즈는 실험실에서 제조한 하 이드로겔 콘택트렌즈(Ref.-HL, Table 1), 100-300 kDa 키토산 가교 콘택트렌즈(IPN-S), 600-800 kDa 키토산 가교 콘택트렌즈(IPN-L) 이었다.
3)콘택트렌즈에 흡착된 단백질 추출 및 정량
콘택트렌즈에 흡착된 단백질은 2% SDS(sodium dodecyl sulfate, 0.1% dithiothreitol) 완충용액(250 ㎕)에서 15분 동안 가열(95℃)하여 추출하였다. SDS 완충용액은 pH 8.00에 맞추어 0.01M Tris 완충용액 에 넣고 제조하였다13).
추출한 단백질의 정량은 Micro Lowry Total Protein Kit(TP0300, Sigma-Aldrich, USA)를 이용 하여 660㎚에서 흡광도를 측정하였으며, BSA (bovine serum albumin)를 사용하여 표준 검량곡선 을 작성하였다14). 단백질의 추출은 시료 당 5개의 콘 택트렌즈를 사용하였다.
5.광 투과율 측정
광학적 특성을 평가하기 위해 GENOVA NANO (Bibby Scientific, UK)를 이용하여 광 투과율을 측 정하였으며, 시료 당 5개의 콘택트렌즈를 사용하여 평균을 계산하였다15).
6.함수율 측정
표면의 수분을 제거한 콘택트렌즈 무게를 측정한 다음 수화된 콘택트렌즈를 40℃의 건조기에서 48시 간 동안 건조하여 아래 식을 통해 무게를 측정하였으 며, 시료 당 5개의 콘택트렌즈를 사용하여 평균을 계 산하였다.
7.접촉각 측정
콘택트렌즈 표면의 접촉각은 Drop Shape Analyzer (DSA 100, Krüss, Germany)를 사용하였다. 측정방법 은 상온에서 증류수 4.5uL를 콘택트렌즈의 표면에 떨 어뜨려 습윤성을 평가 하였으며, 시료 당 5개의 콘택트 렌즈를 사용하여 평균을 계산하였다.
8.AFM(atomic force microscope) 측정
콘택트렌즈 표면의 거칠기는 AFM(NX10, Park systems)을 사용하였으며, 시료 당 5개의 콘택트렌 즈를 측정하여 평균을 계산하였다.
Ⅲ.결과 및 고찰
1.단백질 흡착 특성
제조한 콘택트렌즈의 단백질 흡착 특성을 평가한 결과 분자량 100-300 kDa 과 600-800 kDa 석시닐 -키토산이 가교 되어 있는 IPN-S 및 IPN-L 콘택트 렌즈의 경우 키토산이 가교 되지 않은 Ref.-HL에 비 해 단백질 흡착량의 감소를 나타냈다.
가교에 사용된 석시닐-키토산은 다수의 히드록시 기(-OH)와 아민기(-NH2)를 가지고 있어 물과 강한 수소결합으로 인해 친수성을 나타낸다. 콘택트렌즈의 친수성이 증가하면 렌즈 표면을 보호하여 단백질의 구조적 변화 및 단백질의 흡착을 감소하는 것으로 알 려져 있다16-20). 이에 콘택트렌즈에 가교된 석시닐- 키토산의 친수성 증가에 의해 단백질 흡착량이 감소 한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1, Table 3).
또한, 600-800 kDa 석시닐-키토산이 가교 되어 있 는 IPN-L이 100-300 kDa 키토산이 가교 되어 있는 IPN-S에 비하여 단백질 흡착량이 적게 나타나 가교된 키토산의 분자량이 단백질 흡착에 영향을 주는 것으로 나타났다. 이는 분자량이 큰 석시닐-키토산이 작은 경 우보다 친수성 작용기를 더 많이 포함하므로 하이드로 겔 콘택트렌즈 표면의 친수성을 더욱 증가시켜, 단백질 흡착량을 감소시키는 것으로 보여 진다7-9).
2.광 투과율
가시광선 투과율을 확인한 결과 IPN-S는 92.15%, IPN-L은 91.06%로 Ref.-HL(92.35%)에 비해 약간 낮아졌으며, 가교한 석시닐-키토산의 분자량의 크기 에 따라 약간의 영항을 받는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2, Table 4).
3.함수율
함수율 측정 결과, IPN-S의 함수율은 약 45% 정도 로 나타났으며, IPN-L의 함수율은 약 47% 정도로 나타 났다. 반면 대조군으로 제조한 콘택트렌즈의 함수율은 약 43% 정도로 나타나 가교된 석시닐-키토산이 친수성 증가에 도움을 주는 것을 확인할 수 있었다.
이는 가교에 사용된 키토산의 풍부한 히드록시기 (-OH)와 아민기(-NH2)의 물과의 강한 수소결합을 통해 친수성 증가에 영향을 주는 것으로 생각된다 (Table 5).
4.접촉각
제조한 콘택트렌즈의 습윤성을 알아보기 위해 접 촉각을 측정한 결과, 분자량 100-300 kDa 과 600-800 kDa 석시닐-키토산이 상호침투가교 되어 있는 IPN-S 및 IPN-L 콘택트렌즈의 경우 석시닐- 키토산이 가교 되지 않은 Ref.-HL에 비하여 접촉각 이 감소하는 것으로 나타나 습윤성이 증가하는 것으 로 확인되었다(Table 6, Fig. 3).
또한 600-800 kDa 석시닐-키토산이 상호침투가 교 되어 있는 IPN-L이 100-300 kDa 석시닐-키토 산이 가교 되어 있는 IPN-S에 비하여 접촉각이 낮게 나타나 가교된 키토산의 분자량이 접촉각에 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다. 이는 분자량이 큰 석시 닐-키토산이 작은 경우보다 친수성 작용기를 더 많 이 포함하여, 하이드로겔 렌즈 표면의 습윤성을 더욱 증가시킨다9).
따라서 함수율 결과와 마찬가지로 석시닐-키토산 의 히드록시기(-OH)와 아민기(-NH2)에 의한 물과의 수소결합 증가로 인해 접촉각이 감소 된 것으로 판단 하였다.
5.AFM(atomic force microscope) 표면분석
원자힘 현미경(atomic force microscope)을 이용 하여 제조한 콘택트렌즈의 표면을 분석하였다. 그 결 과 대조군으로 제조한 Ref.-HL과 비교했을 때 석시 닐-키토산 가교 콘택트렌즈(IPN-S, IPN-L) 거칠기 가 약간 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이는 키토산 가교 시 몰드를 사용하지 않았기 때문에 표면 거칠기 (Surface roughness) 값이 증가한 것으로 사료된다. 또한, 가교한 석시닐-키토산의 분자량에 따라 표면 거칠기 값이 약간 증가하는 것으로 나타났다.
이러한 석시닐-키토산 가교에 의한 표면 거칠기는 nm 사이즈에서 미미한 수준에서 증가하였기 때문에 광 투과율에 미치는 영향은 거의 없는 것을 확인할 수 있었다. 또한, p(HEMA) 네트워크와 석시닐-키토 산 사슬이 IPN을 통해서 서로 묶여 있기 때문에, 불 투명도를 높이는 거시적 상 분리가 일어나지 않았기 때문으로 보인다.
제조한 콘택트렌즈의 AFM 현미경 분석 결과를 Fig. 4와 Table 7에 각각 나타내었다.
Ⅳ.결 론
본 연구는 석시닐-키토산을 합성하여 p(HEMA) 하이드로겔과 상호 침투 가교 하는 방법으로 콘택트 렌즈를 제조하고, 각각의 물리적 성질 및 단백질 흡 착특성에 대하여 알아보았다.
단백질 흡착 특성의 경우 분자량 100-300 kDa 과 600-800 kDa 석시닐-키토산이 가교 되어 있는 IPN-S 및 IPN-L 콘택트렌즈의 경우 석시닐-키토산 이 가교 되지 않은 Ref.-HL에 비해 단백질 흡착량의 감소를 나타냈으며, 가교된 석시닐-키토산의 분자량 이 클수록 단백질 흡착량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 분자량이 큰 석시닐-키토산이 작은 경 우보다 친수성 작용기를 더 많이 포함하여, 하이드로 겔 콘택트렌즈 표면의 습윤성을 더욱 증가시키기 때 문이다.
또한 석시닐-키토산이 가교된 경우 함수율의 증가 와 접촉각의 감소를 나타내어 콘택트렌즈의 착용감에 중요한 습윤성의 증가를 확인하였다. 이는 가교에 사 용된 석시닐-키토산이 다수의 히드록시기(-OH)와 아민기(-NH2)를 가지고 있어 물과의 강한 수소결합 으로 인해 친수성이 증가하였고 콘택트렌즈의 친수성 증가에 의해 콘택트렌즈 표면을 보호하여 단백질의 구조적 변화 및 단백질의 흡착을 감소한다.
따라서 석시닐-키토산을 p(HEMA) 하이드로겔과 상호 침투 가교 하는 방법을 이용하여 기존의 콘택트 렌즈가 가지는 물성을 해치지 않으면서 습윤성이 뛰 어나고 단백질의 흡착을 줄일 수 있는 콘택트렌즈 제 조가 가능할 것으로 생각된다.
