Ⅰ. 서 론

콘택트렌즈의 착용이 보편화되면서 그에 따른 부작 용도 증가하고 있다. 각막염의 많은 원인 중에서도 콘 택트렌즈 착용으로 인한 감염성 각막염은 가장 심각하 고 중요한 합병증 중 하나로, 경한 결막 및 각막의 손 상에서부터 실명으로 이어질 수 있는 심한 각막궤양까 지도 생길 수 있다.¹⁾ 이러한 감염성 합병증에 관여하 는 요소로는 렌즈의 재질, 착용 습관, 렌즈의 미생물 부착 및 렌즈 케이스의 미생물 오염 등이 있다.²⁾ 이 중 에서 콘택트렌즈 케이스의 미생물 오염은 감염성 각막 염의 중요한 원인으로 콘택트렌즈에 의한 각막궤양 환 자에서 렌즈 케이스의 미생물 오염 정도는 보고에 따 라 차이는 있으나 매우 높다고 보고되었고,³⁾ Bharathi 등⁴⁾도 콘택트렌즈 케이스의 세균오염이 소 프트렌즈 착용 관련 감염성 각막염의 큰 위험 요소임 을 의심할 여지가 없었다고 보고하였다. 이런 감염성 각막염을 일으키는 가장 대표적인 세균으로 그람양성 균은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)이며, 그람음성균은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으 로 알려져 있다.⁵⁾

미생물을 동정하는 방법으로는 주로 배양법, 효소 면역법 및 생화학적 검사 등의 방법으로 수행되어 왔으 나, 현재에는 환경적 요인에 의해서 거의 영향을 받지 않는 데이터를 제공하고 또한 신속한 동정이 가능하며 유전형질의 진화적 개념을 도입한 16s rRNA 유전자 염기서열 분석법이 널리 사용되고 있다.⁶⁾ 이 분석법은 1980년대 Carl Woese 등은 당시에 가장 최신의 기법 이었던 sequencing 방법을 이용하여 다양한 세균의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하여 계통분류학 연구에 이용하였으며, 이후 세균 분류 및 동정에 있어 서 모든 세균에 존재하는 16S rRNA 유전자는 아주 이 상적인 분자로 인정받아 널리 이용되고 있다.⁷⁾ 하지만 콘택트렌즈 및 관련용품에서 분리한 균주들을 동정할 때 생화학적인 방법을 주로 사용하고 있는 실정이다. 그리고 세균성 각막염의 치료에 있어서 예전에는 그람 양성균에 효과적인 cephalosporin계와 그람음성균에 효과적인 aminoglycoside계 항생제를 병행하여 치료 하는 방법을 사용하였다.^8-9) 그러나 요즘에는 새로운 세대의 quinolone 광범위 항생제가 개발되면서 임상 에서 주요 치료제로 많이 사용되고 있으며¹⁰⁾ 이들 항생 제의 남용으로 인한 내성의 증가를 초래하고 있는 실정 이다.^11-13) 따라서 본 연구에서는 콘택트렌즈 케이스에 서 분리한 균주들을 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하여 동정하고, 콘택트렌즈에 의한 각막염의 주요 원인균인 Serratia marcescens 균주들에 대해서 세균 성 각막염의 주요 치료제인 quinolone 항생제 1세대 Nalidixic acid(30㎍), 2세대 Ofloxacin(5㎍), Ciprofloxacin(5㎍), 3세대 Levofloxacin (5㎍)를 이 용하여 항생제 감수성 검사를 시행하였다.

Ⅱ. 대상 및 방법

1. 대상 및 시약

2014년 3월부터 7월까지 서울에 소재한 모 대학교 의 학생들이 사용하고 있는 65개의 콘택트렌즈 케이스 를 수거하여 실험에 사용하였다. 현재 안과치료를 받 고 있는 사람의 렌즈 케이스는 제외시켰다. 그리고 대 상자들은 매일착용 소프트렌즈를 사용하였으며, 대부 분 렌즈 케이스를 소독하지 않고 3개월에서 6개월 정 도 사용하였다. 배지는 Luria-Bertani medium (Difco Inc., U.S.A)과 Mueller-Hinton Agar (MB cell Inc., U.S.A)를 사용하였으며, 항생제 디스크는 Nalidixic acid(30㎍), Ciprofloxacin(5㎍), Ofloxacin( 5㎍), Levofloxacin(5㎍) Disc(MB cell Inc., U.S.A)를 사용하였다.

2. 균주 순수분리

균주 분리는 멸균된 면봉으로 수거한 65개의 콘택 트렌즈 케이스를 각각 문지른 후 Luria-Bertani agar media(Difco Inc., U.S.A)에 Streaking하여 24시간 동안 37℃ 배양기 안에서 배양하였다. 24시 간 후에 30개의 플레이트에서 다수의 Colony가 관찰 되었고 각 플레이트마다 colony를 picking 하여 Luria-Bertani broth (Difco Inc., U.S.A) 3ml가 들 어있는 conical tube에 접종하였다. 이 tube를 다시 회전 배양기에서 37℃, 250rpm의 조건으로 24시간 동안 배양하여 균주를 순수 분리하였다.

3. 16S rRNA PCR 및 동정

분리된 균주를 동정하기 위해 먼저 Puregene Yeast/Bact. kit B(Qiagen Inc., U.S.A.)를 사용하 여 genomic DNA를 추출하고 16S-F, 16S-R primer(Table 1)를 사용하여 PCR를 통해 16S rRNA gene를 증폭하였다. PCR 반응 용액은 genomic DNA 50ng(1㎕), 2X BluePreMix-HF Taq (Macrogen Inc., Korea) 10㎕, forward primer 1 ㎕, reverse primer 1㎕, DW 7㎕ 합계 20㎕를 튜브 에 넣어 증폭하였다. PCR 반응 조건은 95℃에서 5분 간 충분히 denaturation 후, 95℃에서 30초 denaturation, 55℃에서 30초 annealing, 72℃에서 1분 40초 elongation 반응을 35 cycle 수행 후 72℃ 5분간 최종 elongation을 수행하였다. Sequencing 은 Macrogen Inc., Korea에서 27F, 1492R primer 를 이용해 염기서열을 분석하였으며(Table 1), 결과 는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 program을 이용하여 검색한 후 GenBank에 등재된 세균들의 16S rRNA 유전자 염기 서열과 비교하여 균주를 동정하였다.

4. 항생제 감수성 검사

디스크 확산법(Disc diffusion method)으로 실시 하였고, MacFarland 0.5의 탁도로 현탁하여, 멸균된 면봉으로 균주를 Mueller-Hinton Agar에 도말하였 다. 그리고 Nalidixic acid(30㎍), Ciprofloxacin(5 ㎍), Ofloxacin(5㎍), Levofloxacin(5㎍) 항생제 Disc를 올려놓고 37℃에서 18시간 배양 후 억제된 지 름을 측정하였다. 항생제 감수성 기준은 CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) 2014년에 준하여 측정하였고, 표준균주 Escherichia coli ATCC 25922 균주를 control organism으로 사 용하였다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. 16S rRNA gene 분석을 이용한 동정

동정은 16S rRNA PCR을 수행하여 NCBI의 BLAST program을 이용하여 비교 분석한 결과 GenBank에 등재된 세균들과 16S rRNA 유전자 염기 서열이 99% 상동성으로 나온 동정 결과를 얻을 수 있 었다. 동정된 균주로는 Achromobacter sp. 8균주, Achromobacter xylosoxidans 3균주, Achromobacter spanius 1균주, Pandoraea pnomenusa 1균 주, Serratia marcescens 17균주, 총 5종의 30균주 가 동정되었으며, 모두 그람음성균이였다(Table 2).

콘택트렌즈와 관련된 세균각막염에서는 대체로 그 람음성균의 비율이 높다고 알려져 있다. 본 연구에서 도 콘택트렌즈 케이스에서 분리한 균주들이 100% 그 람음성균으로 나타났으며, 콘택트렌즈와 관련된 세균 각막염을 일으키는 그람음성균의 비율이 타 연구와 같거나 조금 높게 나타났다.^15-16) 그리고 본 연구에서 65개의 콘택트렌즈 케이스 중에 30개의 렌즈 케이스 에서 세균이 검출되었으며 나머지 35개의 렌즈 케이 스에서는 세균이 검출되지 않았다. 약 46%의 세균 오 염도를 보였으며, 검출된 30개의 균주 중 가장 많이 검출된 균주는 S. marcescens로 전체 균주 중에 약 57%를 차지하였고, 그 외 Achromobacter sp. 27%, A. xylosoxidans 10%, P. pnomenusa가 3%를 차지 하였다(Fig. 1). 다른 연구에서는 감염성 각막염이 없 는 정상적인 렌즈 사용자의 케이스 중에서 오염도가 40~50% ^17-18) 높게는 74~82%^19-20)라고 보고되었다. 본 연구에서도 46%로 비슷한 수치에 해당하는 높은 오염도를 보였다.

Sohn and Kwak²¹⁾의 연구에서는 적어도 일주일에 한 번은 계면활성제를 사용해 렌즈 케이스 안팎을 문 질러서 닦아줄 것을 권고하였다. 콘택트렌즈는 일단 사용을 시작하면 표면에 미생물이 부착하게 되는데 착 용 후 24시간 이내에 콘택트렌즈 표면에 lysozyme, albumin 등이 침착하게 되고 이물질 대부분 미생물의 부착을 활성화시킨다.^22-23) 또한 콘택트렌즈가 고 분 자로 덮일 경우 시력을 떨어뜨리고 산소투과율을 떨어 뜨리게 되어 저산소증으로 인한 각막 상피의 상처를 초래할 뿐 아니라 이들이 항원으로 작용할 경우 과민 성 결막염을 일으킬 수 있으며 미생물이 점액에 의해 덮인 렌즈에 붙어서 병원소로 작용되어 세균의 전이증 식을 가능하게 한다고 하였다.²⁴⁾ 1980년대 이후로는 콘택트렌즈가 세균성 각막염의 주요한 원인이 되고 있 다. Liesegang²⁵⁾의 연구에서 40년 동안 각막염 발병 이 4배 이상 증가하였고, 그것은 콘택트렌즈 착용의 증가와 직접적인 관련이 있다고 보고하였다. 또한 전 체 세균성 각막염 중 콘택트렌즈가 원인으로 차지하는 부분이 국내 여러 연구에서 각 40.5%²⁶⁾, 55.4%²⁷⁾, 42.0%²⁸⁾ 등으로 보고되었으며, 콘택트렌즈 착용 자체 가 세균성 각막염 발병의 유의한 위험인자라고 보고하 였다.^27-28)

Achromobacter xylosoxidans에 의한 안과감염으 로는 국내에 많은 보고가 되어있지 않았지만 유행성 각 결막염 후 합병증으로 발생한 각막염과 콘택트렌 즈 착용 후 발생한 각막염이 보고되었다.^29-30) 기능적 으로 편모를 가지고 있고, 운동성이 있는 호기성 그 람 음성 간균으로 수영장, 하수 침전물 등과 같은 다 양한 종류의 물이나 흙, 특히 식물의 뿌리가 있는 토 양 환경에서 주로 발견된다고 알려져 있다.^31-32) 그리 고 가장 많이 동정된 Serratia marcescens는 장내세 균과(Enterbactriaceae) 그람음성 간균으로 토양과 물에서도 상재하고, 기회 감염균으로 알려져 있으며, Pseudomonas aeruginosa 와 함께 오염된 콘택트렌 즈 저장용기에서 흔히 분리되고, 콘택트렌즈 착용과 연관되어 Serratia marcescens 각막염이 발생한다고 보고하였다.^26,33-36) 특히 콘택트렌즈 관련 감염성 각 막염의 약 18%를 차지하는 흔한 균이라고 보고되었 다.³⁷⁾ 본 연구에서는 렌즈 케이스에서 검출된 균주 중 Serratia marcescens가 약 57%를 차지하였으며, 콘택트렌즈와 관련해서 상당히 많이 검출된다는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 콘택트렌즈 표면이나 보관 용기에 형성되는 biofilm은 세균의 부착과 증식에 좋 은 환경으로 작용하며, 세척이나 소독 시 콘택트렌즈 의 살균효과를 떨어뜨리는데, Serratia marcescens 는 bacterial biofilm을 형성하므로 다른 세균들보다 콘택트렌즈와 연관된 각막염에 대한 발생률이 높게 나타난다고 한다.^38-39) 콘택트렌즈 케이스의 오염정 도를 줄이기 위해서는 렌즈케이스의 안쪽 벽에 형성 된 biofilm을 렌즈 세척액을 묻힌 면봉으로 깨끗이 닦아내고 뜨거운 물로 10분 이상 소독한 뒤 공기 중 에 말리는 것을 주기적으로 시행하며 3~6개월마다 렌즈 케이스를 교체해야 하며, 렌즈를 장기간 사용하 지 않고 보관할 때에도 주기적으로 소독을 실시하는 것이 바람직하다고 하였다.³⁴⁾ 따라서 감염성 각막염 을 예방하기 위해서 가장 중요한 것은 정기적인 케이 스 교체와 소독이 반드시 시행되어야 할 것으로 사료 된다.

2. Quinolone 계 감수성 검사

콘택트렌즈에 의한 세균성 각막염의 주요 원인균인 Serratia marcescens 17균주를 quinolone 계 감수성 검사에 실시하였으며 다음과 같은 일련번호를 사용하 였다(Table 3). 항생제 감수성 검사는 디스크 확산법 (Kirby-Bauer disc diffusion method)으로 실행하 였으며, CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute) 2014년의 기준으로 나타낸 결과 quinolone계 1세대인 Nalidixic acid에서 100% 감수 성, 2세대인 Ciprofloxacin, Ofloxacin에서 100% 감 수성, 3세대인 Levofloxacin에서도 100%의 감수성을 나타냈다. 콘택트렌즈 케이스에서 분리한 Serratia marcescens 17균주에 quinolone계 Nalidixic acid, Ciprofloxacin, Ofloxacin, Levofloxacin 모두 100% 감수성으로 나타났다(Table 3, Fig. 2).

Yoon JH 등⁴⁰⁾ 연구에서는 2000년에서 2011년까 지의 환자를 대상으로 실시한 항생제 감수성 검사에 서 Serratia marcescens 균주에 대한 감수성으로 Ciprofloxacin 93.3%, Levofloxacin 100%의 감수성 을 보였으며, 그람음성균에 대한 quinolone 항생제 감수성으로 Ciprofloxacin, Levofloxacin에 대하여 각각 90.3%, 99.0%로 나타났다. 또한 Lim SH⁴¹⁾ 둥 은 Ciprofloxacin에 10.8%, Levofloxacin에 9.1%의 낮은 내성률을 보였고, Song YA⁴²⁾ 등 연구에서는 Ciprofloxacin에 2000년도에는 100% 감수성, 2006 년도에는 84.2%으로 감수성이 감소하는 추세로 이 항생제에 대한 내성이 증가하는 경향을 보였다.

치료에 있어서 가장 중요한 것은 원인균을 동정한 후에 감수성 있는 항생제를 선택하여 사용하는 것이 다. 하지만 임상에서는 배양검사 결과 없이 주요 치 료제로 quinolone계 광범위 항생제를 사용하고 있는 실정이며,^10,43-44) 내성의 증가를 초래한다고 보고되 고 있다.⁴⁵⁾ 근래에는 병원균의 항생제 내성 문제가 전 세계적인 공중보건 문제로 많이 대두되고 있는 실 정이다.⁴⁶⁾ 이번 연구에서는 콘택트렌즈와 관련해서 흔히 분리되는 Serratia marcescens 균주에 대해서 만 quinolone 항생제 감수성 검사를 실시하였는데 향후 Pseudomonas aeruginosa 등의 균주에 대해서 도 quinolone 항생제 감수성 검사에 대한 연구가 계 속 되어야 할 것으로 생각된다. 또한 세균성 각막염 의 치료 등 항생제의 지속적인 사용으로 점차적으로 내성이 증가하는 추세에 있을 것이라 생각되며 반드 시 quinolone 항생제의 내성 발생률에 대한 체계적 인 연구와 관리가 필요한 것으로 사료된다.

Ⅳ. 결 론

총 65개의 콘택트렌즈 케이스 중에 30개의 렌즈 케 이스에서 세균이 검출되었으며, 분리된 균주들을 16S rRNA gene 염기서열 분석으로 동정한 결과 Achromobacter sp. 8균주, Achromobacter xylosoxidans 3균주, Achromobacter spanius 1균주, Pandoraea pnomenusa 1균주, Serratia marcescens 17균주, 모 두 5종의 30균주가 동정되었다. 그리고 콘택트렌즈에 서 가장 흔하게 분리되는 Serratia marcescens 17균 주에 대한 항생제 감수성 검사에서 quinolone 항생제 1세대인 Nalidixic acid에서 100% 감수성, 2세대인 Ciprofloxacin, Ofloxacin에서 100% 감수성, 3세대인 Levofloxacin에서도 100%의 감수성으로 나타났다. 그러나 항생제의 지속적인 사용으로 내성 균주들이 나 타날 것으로 예측되며 quinolone 항생제의 내성 발생 률에 대한 체계적인 연구와 관리가 필요한 것으로 사료 된다.