Ⅰ. 서 론

콘택트렌즈는 안경에 비해 넓은 시야, 수차 감소, 부등시, 미용 목적, 운동 시의 편리성, 안경착용에 대 한 불편함 등의 장점들 때문에 그 사용도 증가하고 있다.¹⁾ 그러나 콘택트렌즈 착용으로 부작용을 일으키 기도 한다. 부작용으로는 각막 신생혈관, 각막반흔, 각막미란, 각막궤양, 각막기질 침윤, 각막상피 미세 낭포, 표층점상 각막염, 상윤부 각결막염, 거대유두 결막염 등이 발생하며 가장 심각한 합병증은 감염성 각막염이다.²⁾ 감염성 각막염은 사용하는 렌즈의 재 질, 착용습관, 렌즈의 미생물 부착 정도, 렌즈 용기의 미생물 오염 등의 여러 요소에 의해 발생하게 된다. 렌즈 관련 용품의 세균 감염에 대한 조사에서 콘택트 렌즈에서 9%, 렌즈 케이스에서 34%, 용액에서 11%의 세균이 검출되었다고 보고되었다.³⁾

각막은 안구의 외막 중 가장 바깥쪽에 위치한 투명 한 무혈관 조직으로서, 빛의 굴절과 전달에 주요한 기 능을 한다. 그리고 혈관이 없는 각막 기질은 특히 세 균감염에 민감하며, 콘택트렌즈를 착용하면 각막상피 의 저산소증과 고이산화탄소증에 의해 각막상피의 대 사 작용이 감소하고 각막 지각도가 감소되어 젖산의 축적으로 인해 각막기질 부종과 내피세포 변형을 유발 시킨다. 따라서 렌즈의 장시간 착용은 각막의 산소 부 족을 유발하게 되고 약해진 각막상피 손상부위를 통하 여 병원균이 침입하면 각막염이 발생하게 된다.^4-6)

콘택트렌즈와 관련된 감염성 각막염의 주원인으로 는 크게 세균(Bacteria), 진균(Fungus), 아칸트아메 바(Acanthamoeba) 등이 있다. 이러한 감염성 각막염 의 가장 흔한 원인균은 그람양성균에서는 표피포도상 구균(Staphylococcus epidermdis)이고,⁷⁾ 그람음성 균에서는 간균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 으로 알려져 있다.⁸⁾ 진균 감염으로는 약 82%는 Candida에 의해 나머지는 Aspergillus에 의한 감염 으로 알려져 있으며,⁹⁾Acanthamoeba는 오염된 물속 에서 서식하는 원생동물로 아칸트 아메바성 각막염의 85%가 콘택트렌즈와 관련 있는 것으로 알려져 있 다.¹⁰⁾ 이러한 미생물들에 의한 감염성 각막염의 치료 에 있어서는 먼저 원인균을 제거하고, 염증반응을 억 제하여 치료에 목적인 정상적인 각막의 구조를 회복 시키는데 있다. 세균에 의한 감염성 각막염의 치료에 있어서 예전에는 일차적으로 고농도의 cephalosporin계와 aminoglycoside계 항생제를 병행하여 사 용하는 방법을 사용하였다.^11-12) 그러나 최근에는 새 로운 세대의 fluoroqunolone계 광범위 항생제가 개 발되면서 일차 치료제로 많이 사용되고 있다.¹³⁾

Fluoroquinolone계 항생제는 1980년대 말 이후 의학 및 수의학분야에 도입되어 현재까지 널리 사용 되고 있는 광범위 합성 항균제로서, 1980년대 후반부 터 안과 용제로 사용하기 시작하였으며, 장점으로는 낮은 안구 독성, 좋은 각막투과성, 실온에서의 안정 성이 있고, 그람양성균과 그람음성균을 모두 억제할 수 있는 광범위 항생제로 세균감염증의 치료에 많이 사용하고 있다.^14-16)

치료에 있어서 가장 중요한 요소는 먼저 원인균을 동정한 후 감수성 있는 항생제를 선택하여 사용하는 것이다. 동정이란 세균을 순수 분리하여 생화학적인 검사 방법 또는 16S rRNA 유전자 분석 방법 등으로 균주가 어떤 종(species)인지를 알아내는 과정을 의미 한다. 그러나 임상에서는 배양검사 결과 없이 일차 치 료제로 fluoroquinolone계 항생제를 사용하고 있는 실정이며,^{17-18, 13)} 항생제의 부적절한 사용으로 치료의 실패로 이어지거나, 병원균의 내성의 증가를 초래하 고 있는 실정이다.^19-21) 따라서 본 연구에서는 2009년 7월부터 2010년 1월까지 원주지역 안과의원에서 콘택 트렌즈의 부작용으로 감염성 각막염이 의심되는 기질 성 침입 환자 각막에서 검출한 균주를 이용하여 감염 성 각막염 일차 치료제로 주로 쓰이는 fluoroquinolone계 항생제 Ofloxacin(5㎍/㎖), Ciprofloxacin (5㎍/㎖), Levofloxacin(5㎍/㎖)이 첨가된 배지에서 분리된 균주를 16S rRNA gene 염기서열 분석에 의해 동정하고, 항생제 감수성 검사인 디스크 확산법으로 균주의 내성 및 감수성을 파악하였다. 또한 내성균주 에 대해서는 fluoroquinolone의 주요 내성기전에 관 여하는 gyrA 유전자 QRDR 부위의 DNA 염기서열을 분석하여 내성의 원인을 알아보고자 한다.

Ⅱ. 대상 및 방법

1. 대상 및 균주분리

2009년 7월부터 2010년 1월까지 원주지역 안과의 원에서 세극등 현미경 검사를 시행한 결과 콘택트렌 즈 부작용으로 감염성 각막염이 의심되며 다른 안과 적 질환이 없는 기질성 침입환자 30명의 단안을 대상 으로 실험하였다. 대상자는 14세에서 29세 사이였으 며 30명 모두 여성들이였다.

먼저 환자의 각막을 0.5% Proparacaine Hydrochloride( Alcon Inc., U.S.A)로 점안 마취 후 각막의 가장자리 또는 기저 면에서 멸균된 면봉으로 조직을 긁 어내어 시료를 채취한 후 LB(Luria-Bertani) agar (Difco Inc., U.S.A)에 접종하여 37℃에서 24-48시간 배양하였다. 균주의 분리에는 총 65개의 콜로니 (colony)를 분리하여 실험에 사용하였으며, 3종류의 항생제 Ofloxacin(5㎍/㎖), Ciprofloxacin(5㎍/㎖), Levofloxacin(5㎍/㎖)(Sigma Inc., U.S.A)이 첨가된 배지에 분리한 균주들을 각각 접종하여 37℃에서 24시 간 배양 후 배양된 균주만 선별하였다.

2. 항생제 감수성 검사

항생제 감수성 검사는 디스크 확산법(Kirby- Bauer disc diffusion method)으로 실시하였고, 배 양된 Staphylococcus spp. 균주들을 MacFarland 0.5의 탁도로 현탁하여, 멸균된 면봉으로 Mueller- Hinton Agar(MB cell Inc., U.S.A)에 균주들을 각각 도말하여 Ofloxacin(5㎍), Ciprofloxacin(5㎍), Levofloxacin(5㎍) Disc(MB cell Inc., U.S.A)를 올 려놓고 37℃에서 18시간 배양하였다. 항생제 감수성 기준은 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)에 준하여 균주의 억제대 지름을 조사하고 내성 및 감수성 정도를 알아보았다. 그리고 Staphylococcus aureus ATCC 25923과 Escherichia coli ATCC 25922 균주를 control 균주로 사용하였다.

3. Genomic DNA 분리

균주의 genomic DNA는 Puregene Yeast/Bact. kit B(Qiagen Inc., U.S.A.)를 사용하여 분리하였다. 균주를 LB 배지에 접종하여 20시간 배양한 후 E-tube에 균액 500㎕를 넣고 13000rpm, 4℃에서 1 분간 원심 분리 후 상등액을 버리고 균체를 회수하였 다. 그리고 균체에 cell lysis solution 300㎕를 넣고 재 현탁한 후 80℃ water bath에서 5분간 반응시키 고 1.5㎕ RNase A solution을 첨가한 후 37℃에서 60분간 반응 후 얼음에 1분간 정치하여 protein precipitation solution 100㎕를 넣고, 20초간 섞은 후 13000rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하였다. 그 후 isopropanol 300㎕를 새로운 E-tube에 넣고 원 심 분리한 균주의 상층액을 옮겨 섞어주고 13000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하고 상층액을 버린 후 70% ethanol 300㎕을 첨가하여 DNA 침전 을 세척하고 다시 13000rpm, 4℃에서 5분간 원심분 리 후 상층액을 버리고 알코올이 날아가도록 15분간 건조하였다. 그 후 DNA hydration solution 50㎕를 넣고, 5초간 vortex 한 후 65℃에서 1시간 동안 정치 하고, 전기영동으로 DNA가 정제되었는지 확인한 후 PCR 반응의 주형으로 사용하였다.

4. PCR(Polymerase Chain Reaction) 증폭

각 균주들을 동정하기 위한 16S rRNA 증폭²²⁾ 및 gyrA 유전자 증폭²³⁾을 위한 PCR 실험에 사용한 primer는 다음과 같다(Table 1).

PCR 반응 용액은 주형 DNA 50ng(1㎕), 2X Blue PreMix-HF Taq(Macrogen Inc., Korea) 10㎕, primer 10pmol 1㎕씩 첨가하여 최종 20㎕가 되도록 멸균된 3차 증류수를 PCR 튜브에 첨가해 실험에 사 용하였다. 각각의 PCR 반응 조건은 다음과 같다 (Table 2).

5. DNA 염기서열 분석

증폭된 16S rRNA와 gyrA 유전자의 PCR 반응 후 전기영동을 실시하여 해당 크기의 DNA 절편을 각각 1%와 1.2% agarose gel(Seakem LE,. Bioproducts Inc., U.S.A.)에서 잘라낸 후 MG^TM Gel SV gel DNA extraction kit(Macrogen Inc., Korea)을 이용 해 DNA를 추출, 정제 후 Macrogen Inc., Korea에 서 염기서열을 결정하였다. 분석한 16S rRNA 염기서 열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST program를 이용하여 검색한 후 GenBank에 등재된 세균들의 16S rRNA 유전자 염기서열들과 비교하여 동정하였고, gyrA 유전자의 염기서열 분석에는 BioEdit(Sequence Aligenment Editor, Brown lab) program을 이용하였다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. Fluoroquinolone 항생제 배지에서 배양된 균주들의 16S rRNA 동정

Fluoroquinolone계 항생제가 첨가된 배지에 배양 된 균주는 총 10개의 균주이며, 동정은 16S rRNA PCR을 수행하여 증폭한 결과 1.6kbp 크기의 DNA 단편들을 얻을 수 있었으며(Fig. 1) 염기서열 분석은 NCBI의 BLAST program을 이용하여 비교 분석한 결과 GenBank에 등재된 세균들과 분리된 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열이 99% 이상의 상동성으 로 나온 동정 결과를 얻을 수 있었다.

Ofloxacin이 첨가된 배지에서 배양된 균주는 3개의 분리균주이며, Achromobacter xylosoxidans (N101, N102), Staphylococcus epidermidis(N105)로 동정 되었고, Ciprofloxacin이 첨가된 배지에서 배양된 균 주는 10개의 분리균주이며, Achromo bacter xylosoxidans( N101, N102), Staphylococcus epidermidis( N103, N104, N105, N106), Staphylococcus warneri(N107), Staphlococcus hominis(N108), Staphylococcus saprophyticus(N109), Alcaligenes sp.(N110)로 동정되었다. N101, N102, N105 균주는 Ofloxacin과 Ciprofloxacin이 첨가된 배지에서 모두 다 배양이 되었다. 그러나 Levofloxacin이 첨가된 배 지에서는 배양된 세균이 없었다. 이렇게 배양된 균주 로는 그람양성균 7균주, 그람음성균 3균주, 모두 10개 의 균주가 동정되었고 다음과 같은 일련번호를 사용하 였다(Table 3).

Achromobacter xylosoxidans는 편모를 가지고 있고, 운동성이 있는 호기성 그람음성 간균으로 수영 장, 하수침전물 등과 같은 다양한 종류의 물이나 흙, 특히 식물의 뿌리가 있는 토양 환경에서 주로 발견되 며^24-25) 안과감염으로는 유행성 각 결막염 후 합병증 으로 발생한 각막염과 콘택트렌즈 착용 후 발생한 각 막염이 보고되었다.^26-27) 또한 다른 연구²⁸⁾에서는 항 생제 Ciprofloxacin에 내성을 나타낸다고 보고하였 다. 본 실험에 가장 많이 동정된 Staphylococcus epidermidis는 주로 눈꺼풀염, 결막염을 일으키나 세 균성 각막염도 일으킬 수 있다. 전체 세균각막염의 4.1-34.8%로 다양하게 보고되고 있으며, 일부지역에 서는 세균성 각막염의 가장 흔한 원인균이라고 보고 되고 있다.^29-33)

2. 항생제 감수성 검사

항생제 감수성 검사를 실행하여, CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)의 억제대 지 름의 수치기준으로 나타낸 결과 Staphylococcus epidermidis(N105)는 Ofloxacin에 내성으로, Ciprofloxacin과 Levofloxacin은 중간내성으로 나타 났다. 나머지 Staphylococcus spp. 6개 균주들은 모 두 Ofloxacin, Ciprofloxacin, Levofloxacin에 감수 성으로 나타났다(Table 4).

Ofloxacin, Ciprofloxacin 항생제는 지난 10년 간 내성이 증가하였다고 보고되었으며³⁴⁾ 그 원인은 Ciprofloxacin의 경우 오래 전부터 세균성 각막염의 일차 치료제로 많이 사용되었기 때문에 감수성이 저 하되었고, 세균성 각막염의 원인균으로 그람양성균이 많아진 이유도 그람음성균에 비해 항균 효과가 떨어 지는 퀴놀론 항생제의 고유의 특성이라 하였다.³⁵⁾ Alexandrakis 등³⁶⁾은 fluoroquinolone계 항생제에 대한 S. aureus 균주의 내성 발생률이 증가한다고 보 고하였으며, Smitha 등³⁷⁾의 보고에서는 Pseudomonas의 Ciprofloxacin에 대한 감수성이 감소하였 다고 보고하였다. 또한 Yoon 등³⁸⁾의 연구에서도 Ciprofloxacin에 대한 감수성으로 그람음성균과 그 람양성균에서 각각 90.3%와 87.5%, Levofloxacin에 서는 그람음성균에서 99%의 감수성을 보였다고 보고 하였다.

3. gyrA 유전자 분석

gyrA 유전자를 얻기 위해 gyrA-F, gyrA-R primer를 이용하여 PCR을 통해 증폭한 후 gyrA 유 전자의 염기서열을 분석하였다. 임상 검체에서 분리 된 균주에서 추출한 DNA를 주형 DNA로 하여 PCR 증폭한 결과 gyrA 284bp 크기의 DNA 단편들을 얻을 수 있었으며 전기 영동한 결과는 Fig. 2에 나타냈다.

S. epidermidis 감수성 균주(N104, N106)와 내성 균주(N105)의 gyrA gene의 QRDR 부위를 분석한 결 과 감수성 균주에서는 표준형(wild type)과 염기서열 이 같으며 변이가 나타나지 않았다. 그러나 내성균주 S. epidermidis(N105)의 QRDR 부위에서 nucleotide sequence 251번 Cytosine이 Thymine으로 (C→T) 변이된 것을 확인할 수 있었으며, 또한 DNA의 3개의 nucleotide에 의하여 구성되는 아미노산 비교에서는 표준형(wild type)의 codon 84 부위인 아미노산 Serin이 Phenylalanine으로 변이가 나타났다. 즉 Ser(TCT)84→ Phe(TTT)으로 아미노산 변이가 관찰 되었다(Fig. 3).

Fluoroquinolone계 항생제의 작용기전의 표적은 세균의 DNA gyrAse(topoisomerase Ⅱ)와 topoisomerase Ⅳ이다. 주로 세균의 DNA 합성에 필요한 효 소인 DNA gyrAse(topoisomerase Ⅱ)와 topoisomerase Ⅳ의 작용을 억제하여 DNA 복제를 저해함으 로 항균 작용을 나타낸다. DNA gyrAse는 DNA 복제 를 위하여 DNA의 supercoil 구조를 풀어주는 역할을 담당하며, gyrA와 gyrB 유전자에 의해 암호화되며, Topoisomerase Ⅳ는 parC와 parE 유전자에 의해 각 각 암호화된다.^39-40) 또한 fluoroqunolone 항생제의 내성 기전으로는 이 약제의 표적부위인 DNA gyrAse (gyrA, B)와 topoisomerase Ⅳ(parC, E) 유전자의 저항성 결정부위 QRDR(Quinolone resistance determining region)의 아미노산 변이에 의하여 항생 제와의 결합이 억제되어 내성이 나타나는 것이 주요 기전으로 알려져 있으며, 특히 gyrA 유전자의 QRDR 에 변이가 많이 나타난다고 보고되었다.⁴¹⁾

따라서 본 연구에서는 fluoroquinolone계 항생제 의 내성을 보이는 균주로부터 genomic DNA를 분리 하여 항생제 내성에 관련된 표적으로 알려진 gyrA gene의 QRDR 부위를 PCR을 이용해 증폭하고 nucleotide sequence를 분석하여 아미노산 변이를 확인하였다. 한편 다른 신체부위에서 채취한 균주들 의 대한 fluoroquinolone 항생제의 내성기전에 대해 서는 많이 연구가 되어있는 반면 안구나 콘택트렌즈 에서 검출된 균주들에 대한 fluoroquinolone 항생제 의 내성기전에 대한보고는 국내에서는 없었으며, 해 외저널에서는 보고되고 있었다.²³⁾ 또한 감염성 각막 염이 의심되는 환자의 각막에서 직접 채취해 샘플을 얻은 후 실험을 해 더 의미가 있다고 생각된다.

해외 저널에 보고된 M Yamada 등²³⁾ 연구에서도 본 연구와 같은 gyrA gene의 codon 84번 부위에 Ser→Phe으로 변이가 가장 많이 나타났으며, Ser→ Tyr, Ser→Ile으로 인한 변이가 다음으로 많이 나타 났다. 또한 어떤 균주에서는 codon 84번 부위에 Ser →Tyr과 codon 88번 부위에 Glu→Lys으로 이중변이 가 나타났다고 보고되었다. 본 연구에서는 내성균주 가 많지 않았지만 gyrA gene의 codon 84 부위에서 Ser→Phe으로 아미노산 변이로 인한 내성에 영향을 주었으며, gyrA gene이 fluoroquinolone 항생제의 표적임을 확인할 수도 있었다. 그리고 이번 연구에서 는 S. epidermidis 내성균주에 대한 gyrA 유전자 분 석에 관한 연구만 이루어졌는데, 최근 항생제의 내성 문제가 대두되고 있는 만큼 앞으로 감염성 각막염을 일으킬 수 있는 여러 균주에 대한 항생제 내성 기전 의 연구가 이루어질 필요가 있다고 생각된다. 본 연 구에서는 콘택트렌즈를 착용한 후 부작용인 감염성 각막염의 성별에 따른 발생률은 환자 30명 모두 여성 이었다. 이유는 대중매체의 영향을 받아 여성들이 미 용 목적으로 콘택트렌즈를 많이 착용 하고 있는 것으 로 생각되며, 다른 조사에서도 마찬가지로 감염성 각 막염의 발생률이 여성이 52.9%로 높았는데 이는 콘 택트렌즈의 착용이 여성들이 많이 착용하기 때문이라 고 생각된다.^42-43) 감염성 각막염은 콘택트렌즈 사용 시 가장 심각한 합병증으로 적절한 치료가 조기에 이 루어지지 않으면 시력상실을 일으킬 수 있다.⁴⁴⁾ 치료 약제인 quinolone 항생제는 말라리아 치료제인 nalidixic acid가 요로감염증 치료에 사용된 이후부 터 꾸준히 개발되어 왔으며,⁴⁵⁾ 근래에는 fluoroquinolone계 항생제가 그람양성균과 그람음성균 모두에 효과가 있고, 여러 가지의 장점들 때문에 감염성 각 막염의 치료 및 예방에 많이 사용되고 있다.^46-47) 그 러나 임상에서 일차적으로 많이 쓰이고 있는 만큼 내 성균주도 많이 증가하고 있는 추세에 있다. quinolone에 대한 내성은 DNA gyrAse의 A와 B subunit의 변이에 의한 것으로 잘 알려져 있으며 같 은 quinolone 계열들은 서로 상호 교차내성을 갖는 것으로 보고되고 있다.⁴⁸⁾ 본 실험에서도 Staphylococcus epidermidis 균주에 대한 Ofloxacin에서는 내성, Ciprofloxacin, Levofloxacin에서는 중간내성 으로 교차내성이 나타났다. 따라서 치료하는데 있어 우선적으로 원인균을 동정하고, 감수성 있는 항생제 를 선택적으로 사용해야 할 것으로 판단된다.

Ⅳ. 결 론

콘택트렌즈의 부작용으로 감염성 각막염이 의심되 는 기질성 침입환자 각막에서 그람양성균 7균주, 그 람음성균 3균주가 동정되었다. 항생제 감수성 검사에 서 fluoroquinolone 항생제의 내성균주가 나타났으 며, 원인균을 동정한 후 감수성 있는 항생제를 선택 해서 사용해야 할 것으로 판단된다. 그리고 fluoroquinolone 내성기전에 관여하는 표적 gyrA 유전자 QRDR 부위의 DNA를 분석한 결과 codon 84 부위에 서 아미노산 Serin이 Phenylalanine으로 변이가 나 타나 내성에 영향을 미치고 있다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 앞으로 항생제의 계속된 사용으로 많 은 내성균주들이 나타날 것이라 예측되며 fluoroquinolone 항생제를 사용할 때 내성에 대한 주의가 필요할 것으로 생각된다.