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ISSN : 1229-6457(Print)
ISSN : 2466-040X(Online)

The Korean Journal of Vision Science Vol.20 No.3 pp.249-258
DOI : https://doi.org/10.17337/JMBI.2018.20.3.249

Antimicrobial Susceptibility test and DNA gyrase analysis of Coagulase-negative Staphylococci isolated

Hun-Taek Na

Dept. of ocular optics, Gangneung Yeongdong College, Gangneung

Received July 31, 2018 Review September 19, 2018 Accepted September 19, 2018

Abstract

Purpose :

We investigated the susceptibility of quinolone series and vancomycin, erythromycin antibiotics for isolates of Coagulase-negative Staphylococci and analyzed the DNA gyrase gene.

Methods :

Antibiotic susceptibility ofloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, vancomycin, and erythromycin were studied in six strains of coagulase-negative Staphylococci detected in corneas of suspected bacterial keratitis. Antibiotic susceptibility ofloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, vancomycin, and erythromycin were studied in six strains of coagulase-negative Staphylococci detected in corneas of suspected bacterial keratitis. and the genomic DNA of each strain was extracted. After amplifying PCR, DNA of gyraseA gene was analyzed.

Results :

In the antibiotic susceptibility test, ofloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin and vancomycin susceptibility, and erythromycin resistance were observed in strains of S. epidermidis (SE-2, SE-3), S. hominis (SH-1) and S. saprophyticus (SS-1), showing that all of the other strains were susceptible. In the gyraseA gene analysis, amino acid double mutation was observed from S. epidermidis (SE-1) strain as Met75→Thr and Met93→Val, and many silent mutations were observed in strains of S. warneri (SW-1) and S. saprophyticus (SS-1).

Conclusions :

The isolates of Coagulase-negative Staphylococci showed resistance to erythromycin antibiotics, and amino acid double mutation and silent mutation were observed from gyraseA gene analysis. Therefore, although it is not resistance now, potential mutations would be thought that can cause resistance at any time.

Key Words : Coagulase-negative Staphylococci , Antibiotic , gyraseA , Mutation

Coagulase-negative Staphylococci 분리 균주의 항생제 감수성 검사 및 DNA gyrase 분석

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Funding:

Ⅰ. 서 론

안구는 외부에 항상 노출되어 있어서 건강한 상태 를 유지하기 위하여 순목, 눈물에 함유된 리소자임, 면역글로불린, 보체의 항균작용 및 결막의 풍부한 림 프조직 등 다양한 방어기전을 가지고 있다.^1-2) 하지만 정상적인 방어기전이 무너지면 결막염, 각막염, 눈꺼 풀염 등을 표피포도알균(Staphylococcus epidermidis) 을 통해 일으킬 수 있다.^3-4) 특히 각막염을 일으키는 대표적인 원인균 중 하나라고 알려져 있으며, 해외 일부지역에서는 감염성 각막염의 가장 흔한 원인균 으로 보고되었다.^5-7)

Staphylococcus epidermidis는 혈장응고효소(coagulase) 음성(negative)인 그람양성 구균(coccus)으로 정상 피부와 안부속기, 그리고 병원 내에서 주로 발견되는 세균이다.^8-9) 국내의 연구에서 세균각막염을 일으키 는 원인균의 유병률 조사에서 가장 흔한 원인균은 Coagulase-negative Staphylococci 균주가 가장 많았다고 보고하였다.¹⁰⁾ 이런 세균성 안질환의 치료 에 주로 사용되는 약은 quinolone계 점안 항생제이 며 효과적인 항균효과를 지니고 있어서 지금도 다양 하게 사용되고 있다. 그러나 최근 세균성 각막염 환 자들에게 낮은 세대의 quinolone계 항생제에 대한 내성 균주의 보고가 증가하고 있다.^11-14)

Quinolone 항생제는 4-quinolone nucleus라는 이 중 고리 구조를 기본으로 1번 위치에 nitrogen, 3번 위치에 carboxyl group, 4번 위치에 carbonyl group 이 결합되어있는 구조를 지니고 있다.¹⁵⁾ 그 후 1980년 대에 quinolone 구조의 6번 탄소 위치에 fluorine 기, 7번 탄소 위치에 piperazine 고리를 결합시켜 항균범 위가 더욱 넓어지고 강력해진 fluoroquinolone 항생제 로 개발되었다. 그리고 각각의 위치에 다양한 치환 분 을 결합시켜 2세대(ciprofloxacin, ofloxacin), 3세대 (levofloxacin, sparfloxacin), 4세대(gemifloxacin, trovafloxacin) 항생제로 발전하였다.¹⁶⁾ quinolone 항생제는 넓은 범위의 항균효과와 human cell 내로 의 우수한 침투성을 가질 뿐만 아니라 체외로 천천히 배출되기 때문에 상대적으로 긴 반감기를 가지고 있 는 특성을 지니고 있다.^17-20)

Quinolone계 항생제는 세균의 DNA 합성에 필요 한 효소인 DNA gyrase (topoisomerase Ⅱ)와 topoisomerase Ⅳ의 작용을 억제하여 DNA 합성 및 복제를 저해함으로써 항균작용을 나타내며, 내성기전 으로는 이 약제의 target인 DNA gyrase 유전자의 변이가 주요 내성기전으로 알려져 있다.²¹⁾ 그리고 CNS 균주가 해당되는 그람양성균에 효과적이며, quinolone 항생제에 내성이 있을 때 치료제로 사용 되는 vancomycin과 erythromycin 항생제는^22,23) 각각 세균이 생존하는데 필수적인 기능을 하는 세포 벽의 합성단계에서 합성을 억제하는 기전과 세균 리 보솜과 결합하여 단백합성을 억제하는 작용기전을 가지고 있다.^24-25)

따라서 세균성 각막염이 의심되는 사람의 각막에 서 검출하여 ciprofloxacin 항생제가 첨가된 배지에 서 분리된 Coagulase-negative Staphylococci 균 주들을 대상으로 세균성 각막염의 일차 치료제로 주 로 쓰이는 quinolone 계열 항생제 및 그람양성균에 효과적인 vancomycin과 erythromycin 항생제의 감수성 정도를 알아보고 DNA gyrase 유전자를 분 석하고자 한다.

Ⅱ. 대상 및 방법

1. Coagulase-negative Staphylococci 균주들의 genomic DNA 추출

대상으로는 세균성 각막염이 의심되는 30명의 여성 환 자의 각막에서 검출하여 ciprofloxacin (5㎍/㎖)이 첨가 된 배지에서 분리된 Coagulase-negative Staphylococci 6종을 선별하여 대상균주로 사용하였으며 (Table 1), 균 주의 보존은 균 배양액을 20% glycerol이 되도록 조성하 여 -70℃에 보관하며 사용하였다.

균주의 순수 분리는 멸균된 면봉으로 Luria-Bertani agar media (Difco Inc., U.S.A)에 streaking 한 후 24시간 동안 37℃ 배양기에서 배양한 colony를 picking하여 Luria-Bertani broth (Difco Inc., U.S.A) 5ml 가 들어있는 tube에 접종하여 회전배양 기에서 37℃, 250rpm의 조건으로 20시간 동안 배 양하여 균주를 순수 분리하였다. 그리고 순수 분리된 균주를 대상으로 Puregene Yeast/Bact. kit B (Qia gen Inc., U.S.A.)를 사용하여 Coagulase-negative Staphylococci 균주들의 genomic DNA를 추출하였다.

2. 항생제 감수성 검사

검사는 디스크 확산법 (Kirby-Bauer disc diffusion method)으로 실시하였으며, Luria-Bertani agar media에서 배양한 Coagulase-negative Staphylococci 균주들을 MacFarland 0.5의 탁도로 현탁하여, 멸 균된 면봉으로 Mueller-Hinton Agar (MB cell Inc., U.S.A)에 균주들을 각각 도말한 후 ofloxacin (5 ㎍), ciprofloxacin (5 ㎍), levofloxacin (5 ㎍), vancomycin (30 ㎍), erythromycin (15 ㎍) Disc (MB cell Inc., U.S.A)를 올려놓고 37℃에서 18 시 간동안 배양하였다. 항생제 감수성 기준은 CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)에 준하여 균주의 억제 대 지름을 측정하여 감수성 및 내 성 정도를 확인하였다. 그리고 control 균주로는 Staphylococcus aureus ATCC 25923 과 Escherichia coli ATCC 25922 균주를 사용하였다.

3. primer 제작 및 PCR (Polymerase Chain Reaction)

primer 제작은 gyrase-A 유전자 서열을 기준으로 상보적인 짧은 단선의 염기서열로 Macrogen Inc.에 서 100 pM scale로 합성하였다. 합성한 primer는 3 차 멸균 증류수로 최종 10 pM로 희석하여 –20℃에 보관하면서 실험에 사용하였다 (Table 2).

Coagulase-negative Staphylococci 균주의 genomic DNA를 template로 사용하여 gyrase-A 유전자를 PCR을 통해 증폭하였다. PCR 반응 용액은 주형 DNA 50 ng (1 ㎕), 2X BluePreMix-HF (Macrogen Inc., Korea) 10 ㎕, primer 10 pmol 1 ㎕ 씩 첨가 하여 최종 20 ㎕가 되도록 멸균된 3차 증류수를 PCR 튜브에 넣어 주었다. 각각의 PCR 반응 조건은 95℃에서 5 분간 충분히 변성 후, 95℃에서 30 초 denaturation, 55℃에서 30초 annealing, 72℃에 서 30초 elongation 반응을 30 cycle 수행 후 72℃ 5 분간 최종 elongation을 수행하였다 (Table 3). 그리고 PCR 정제는 Plus PCR purification kit (NucleoGen Inc., Korea)를 사용하였다.

4. DNA sequencing 분석

증폭하고 정제한 gyrase-A 유전자는 Macrogen Inc., Korea에서 염기서열 및 아미노산 변이를 결정 하였다. 그리고 sequencing 분석에는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)와 BioEdit program (Sequence Aligenment Editor, Brown lab)을 사용하여 분석하였다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. 항생제 감수성 검사

세균성 각막염이 의심되는 사람의 각막에서 분리한 Coagulase-negative Staphyl-ococci 균주들을 대상 으로 디스크 확산법으로 항생제 감수성 검사를 실시한 후 CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)의 억제 대 지름의 수치기준으로 감수성, 중간내성 그리고 내성 정도를 나타낸 결과 S. epidermidis (SE-1) 균주에서는 ofloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, vancomycin 그리고 erythromycin 모두 감수성으로 나타났으며, S. epidermidis (SE-2, SE-3) 균주에서는 ofloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, vancomycin에서는 감수성으로, erythromycin에서 는 내성으로 나타났다. 또한 S. warneri (SW-1) 균 주에서는 ofloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, vancomycin 그리고 erythromycin 모두 감수성으로 나타났으며, S. hominis (SH-1) 및 S. saprophyticus (SS-1) 균주에서는 ofloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, vancomycin에서는 감수성으로, erythromycin에서 는 내성으로 나타났다 (Table 4).

Yoon 등²⁶⁾의 연구에서는 Coagulase-negative Staphylococci 균주들에 대한 ciprofloxacin 항생제 의 감수성이 87.1%, erythromycin 항생제에서는 감수성 83.9%, vancomycin 항생제에서는 100% 감 수성으로 나왔다고 보고하였으며, Kim 등¹⁰⁾의 연구 에서는 S. epidermidis 균주에 대한 ciprofloxacin 항생제의 감수성이 76.2%, vancomycin 항생제에서 는 100% 감수성으로 나왔다고 보고하였다. 본 연구에 서는 erythromycin 항생제에 대한 감수성이 33.3% 로 다른 연구보다 감수성이 더 낮게 나타났으며, ciprofloxacin 및 vancomycin 항생제에서는 100% 감수성으로 나타났다. 임상적으로 vancomycin 항생 제는 감수성이 높은 장점이 있는 반면 비용과 독성, 짧은 반감기 및 냉장보관 등의 단점을 지니고 있어 임상적으로 사용하는데 이상적이지는 않다고 한 다.^27-28) 하지만 다른 연구에서는 4세대 quinolone 항생제에 대한 내성을 보이는 감염성 각막궤양을 발 견하고, vancomycin 점안을 통해 치료하였다고 보 고되었다.^22-23)

본 연구에서 erythromycin 항생제에서 감수성 저하 가 많이 나타난 이유는 최근에는 세균성각막염 단독치 료제로서의 역할이 많이 감소하였지만, 그람양성균에 효과적인 항생제여서 오래전부터 치료제로 주로 사용해 왔기 때문에 상대적으로 내성균이 많이 나타났다고 생 각된다. 따라서 Coagulase-negative Staphylococci 및 그람양성균이 원인인 세균성 각막염을 치료하는데 있어서 ciprofloxacin 및 vancomycin 항생제 사용 은 문제가 없을 것으로 생각되며, erythromycin 항 생제를 단독으로 치료하는 방법은 고려해야 할 것으 로 생각된다.

2. DNA gyrase 유전자 분석

Coagulase-negative Staphylococci 균주들의 gyraseA 유전자 염기서열을 분석한 결과 S. epidermidis (SE-1) 균주에서는 wild type과 비교해서 nucleotide sequence 224번 T → C, 243번 T → C, 277번 A → G로 mutation이 일어났다. 아미노산 비교에서는 codon 75 부위 Methionine(ATG) → Threonine(ACG), codon 93 부위 Methionine(ATG) → Valine(GTG)으로 아미 노산 이중 변이가 관찰되었으며, codon 81 부위에서는 His81(CAT→CAC) silent mutation이 관찰되었다. 한편 S. epidermidis (SE-2, SE-3) 균주에서는 nucleotide sequence mutation이 나타나지 않았다 (Fig. 1. Table 5). S. warneri (SW-1) 균주에서는 nucleotide sequence 21번 C → T, 72번 G → T, 84번 C → T, 132번 C → T, 234번 G → A로 mutation이 일어났다. 아미노산 비교에서는 Arg7 (CGC→CGT), Leu24 (CTG→CTT), Asn28 (AAC→ AAT), Ile44 (ATC→ATT), Val78 (GTG→GTA)으로 silent mutation이 관찰되었다. (Fig. 2. Table 5).

S. hominis (SH-1) 균주에서는 nucleotide sequence mutation이 관찰되지 않았다. S. saprophyticus (SS-1) 균주에서는 nucleotide sequence 36번 G → T, 78 번 T → A 로 mutation이 일어났으며, 아미노산 비 교에서는 Val12 (GTG→GTT), Gly26 (GGT→GGA) 으로 silent mutation만 관찰되었다. (Fig. 3, 4. Table 5).

Yamada M 등³⁰⁾ 연구에서는 S. epidermidis 균 주의 gyraseA 유전자 codon 84번 부위에 Ser→Phe 으로 mutation이 가장 많이 관찰되었고, 다음으로 Ser→Tyr으로 mutation이 많이 관찰되었다고 보고 하였다. 또한 Dubin DT 등³¹⁾의 연구에서는 S. hominis 균주의 gyraseA 유전자 codon 84번 부위 에 Ser→Ala으로 mutation이 관찰되었다고 보고되 었다. 하지만 본 연구에서는 S. hominis 분리 균주에 서는 mutation이 관찰되지 않았다.

gyraseA 유전자에서 아미노산 mutation이 가장 잘 일어나는 부위는 codon 67 에서부터 codon 106 까지 로 알려져 있으며,^32)-33) 본 연구에서는 해당 부위에 4개의 mutation이 관찰되었다. 먼저 S. epidermidis (SE-1) 균주의 codon 75 부위 Methionine(ATG) → Threonine(ACG)으로, codon 93 부위 Methionine(ATG) → Valine (GTG)으로 아미노산 mutation이 관찰되었으 며, codon 81 부위 Histidine(CAT→CAC)으로 silent mutation이 관찰되었다. 또한 S. warneri (SW-1) 균주 에서는 codon 78 부위 Valine(GTG→GTA)으로 silent mutation 이 관찰되었다. 이런 잠재적인 mutation들이 지금은 내성이 아니지만 점차적으로 내성을 일으킬 수 있을 것으로 생각된다. 사람의 각막에서 분리한 S. warneri, S. hominis, 그리고 S. saprophyticus 균 주 등이 포함된 Coagulase-negative Staphylococci 분리 균주에 대한 quinolone 항생제 내성기전의 국 내 보고는 아직 없었으며, 본 연구에서도 비록 내성 균주는 아니지만 감수성이 저하되고 있는지를 판단 할 수 있는 자료로 활용될 수 있을 거라 생각된다. 따라서 앞으로 항생제 내성 문제에 더 많은 관심을 가져야 할 것이고, 콘택트렌즈의 부작용으로 생긴 세 균성 각막염의 치료제로 많이 쓰이는 만큼 다양한 균 주를 대상으로 내성기전에 관한 연구가 더 활발히 이 루어져야 할 것으로 사료된다.

Ⅳ. 결 론

세균성 각막염이 의심되는 사람의 각막에서 분리한 Coagulase-negative Staphylococci 6 균주들을 대상 으로 항생제 감수성 검사를 실시한 결과 분리된 2 균 주에서 ofloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, vancomycin, 그리고 erythromycin 항생제에 모두 감 수성으로 나타났으며, 분리된 나머지 4 균주에서는 ofloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, vancomycin 에서는 감수성으로, erythromycin에서는 내성으로 나타 났다. 그리고 quinolone 항생제 내성기전에 중요한 역할 을 하는 gyraseA 유전자를 분석한 결과 S. epidermidis (SE-1) 균주에서 codon 75 부위 Methionine → Threonine 으로, codon 93 부위 Methionine → Valine 으로 아미노산 이중 mutation이 관찰되었다. 또한 분리된 3 균주에서 다수의 silent mutation이 관찰되었다. 이런 mutation들이 지금은 내성이 아니 지만 silent mutation이 언제든지 내성을 일으킬 수 있을 것으로 생각된다. 따라서 앞으로도 계속적으로 항생제 내성문제에 더 많은 관심을 가져야 할 것으로 사료된다.

Figure

Figure 1.

Alignment of nucleotide sequences and amino acids of S. epidermidisgyraseA.

Figure 2.

Alignment of nucleotide sequences and amino acids of S. warnerigyraseA gene.

Figure 3.

Alignment of nucleotide sequences of S. hominisgyraseA gene.

Figure 4.

Alignment of nucleotide sequences and amino acids of S. saprophyticusgyraseA.

Table

Table 1.

Bacterial strain used in this experiment.

Table 2.

Primers used in this experiment.

Table 3.

PCR amplification reaction conditions.

Table 4.

Antibiotic Susceptibility Test of Coagulase-negative Staphylococci.

Table 5.

Amino acid substitutions of Coagulase-negative Staphylococci gyraseA.

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