Ⅰ. 서 론

콘택트렌즈용 다목적용액(multipurpose solution, MPS)에는 콘택트렌즈의 세척과 오염방지 및 소독을 위하여 여러 화학물질이 포함되어 있다. International Organization for Standardization(ISO) 14729에는 콘택트렌즈 관리용품에 대한 위생조건, 실험방법, 관리 방법을 규정하고 있으며, 다목적용액은 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus. S. aureus), 메티실린내성 황색 포도상구균(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens. S. marcescens) 와 같은 4 종류의 세균에 대해서는 log 3(99.999%)의 살 균력을, 칸디다 알비캔스(Candida albicans, C. albicans), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani, F. solani)와 같 은 두 종류의 진균에 대해서는 log 1(99.9%)의 살균 력을 가져야 한다고 규정하고 있다.¹⁾ 따라서 다목적 용액은 콘택트렌즈에 부착된 병원균을 소독하고 관리 용액의 세균오염을 막기 위해서 소독제 또는 방부제 성분의 항생물질이 한 종류 또는 두세 종류가 혼합물 의 형태로 사용되고 있다.

항생물질은 콘택트렌즈에 부착된 미생물을 효과적 으로 제거하여 콘택트렌즈를 안전하게 착용할 수 있 도록 도와주지만 항생물질 또는 용액에 포함된 여러 화합물의 복합적인 작용으로 각막상피세포의 성장과 증식을 저해하는 것으로 알려져 있다.²⁾ 따라서 다목 적용액을 제조하는 회사들은 ISO의 규정을 준수하고 독성을 줄이기 위하여 충분한 살균 효과를 나타내는 최저 농도의 항생물질을 사용하여 제품을 제조하고 있다.³⁾ 그러나 이러한 노력에도 불구하고 다목적용액 에 포함된 항생물질은 안구에 독성을 유발하여 각막 상피세포의 세포사(apoptosis)를 유발하거나, 생존률 (cell viability)을 감소시킨다고 보고되었고,^4-6) 실리 콘하이드로겔렌즈와 특정 방부제 성분에 의해 각막염 색 등의 부작용이 유발되었다고 보고된 바 있다.^7–9)

합성보존제 중 polyhexamethylene biguanide(PHMB) 는 강한 양전하를 띤 긴 사슬분자의 화합물로, 세균의 세포막이나 세포벽(cell wall)의 인지질과 선택적으로 결합하여 낮은 농도에서도 살균효과가 우수하여, 수술 부위 소독제, 수영장 소독제 등 광범위한 분야에 사용 되고 있다.¹⁰⁾ 또한 콘택트렌즈 관리용액에 대한 ISO 규 정 균주인 황색포도상구균, 메티실린내성 황색포도상구 균, 녹농균, 세라티아 마르세센스, 칸디다 알비캔스, 푸 사리움 솔라니에 우수한 항균효과를 보여,^10-13) 콘택트렌 즈용 소독액이나 다목적용액에 많이 사용되어왔다. 대 부분의 다목적용액에서는 낮은 농도(1~20 μg/mL)의 PHMB를 사용하고 있고, PHMB를 낮은 농도로 사용할 경우에는 세포 독성이 없다고 보고되었다. 그러나 고농 도(20 μg/mL 이상)에서는 세포독성이 있다고 보고되 었고,¹⁴⁾ PHMB가 포함된 다목적용액을 사용한 경우 자 극감이 유발되었다고 보고된 바 있어,¹³⁾ 우수한 항균 효과를 보이면서 안구독성이 없는 방부제의 지속적인 개발이 필요하다고 할 수 있다.

녹차성분에 포함된 Epigallocatechin gallate(EGCG) 는 녹차 폴리페놀(polyphenol) 함량의 약 50~60%를 차지하는 물질로,¹⁵⁾ 혈전증, 동맥경화, 염증 및 암의 치료에 효과가 있다고 보고되었으며,16~¹⁸⁾ 항산화효 과,¹⁹⁾ 항균효과 및 항바이러스효과^20-22)가 뛰어난 것 으로 알려져 있다. 그러나 낮은 농도의 EGCG는 항균 효과가 충분하지 않고, 콘택트렌즈 관리용액의 ISO 규정 균주인 칸디다 알비캔스에 살균효과가 없다고 보고되어²³⁾ 콘택트렌즈 관리용액의 항균제로 사용되 지 않고 있다. 그러나 EGCG를 다른 항균제와 혼합으 로 사용하면 항균 시너지 효과를 나타내어 우수한 항 균제로 사용될 수 있다고 보고되었고,^24,25) PHMB와 혼합하여 사용할 경우 낮은 농도에서 ISO 규정 안질 환 균주에 대해서 충분한 항균작용을 한다고 보고되 었다.²³⁾ PHMB/EGCG 혼합물은 항산화효과가 우수 하기 때문에 각막상피세포 독성이 없다면 콘택트렌즈 관리용액용 항균제로 충분하리라 생각한다.

다목적용액의 세포독성을 관찰하는 방법으로 과거 에는 다목적용액이 안구에 미치는 안전성과 안구 자 극감 유무의 관점에서 연구가 진행되었으나,²⁶⁾ 최근 에는 세포 배양 모델을 사용하여 독성효과를 확인하 는 연구가 진행되고 있다.2^7-29) 따라서 본 연구에서는 각막상피세포 배양 모델을 이용하여 PHMB와 EGCG의 세포독성 및 PHMB/EGCG의 혼합물이 각막상피세포 에 미치는 세포독성을 확인하여 PHMB/EGCG 혼합 물의 콘택트렌즈 관리용액 항균제로서의 가능성을 확 인하고자 하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 재료

1) 세포배양

실험에 사용된 사람각막상피세포(primary human corneal epithelial cells, HCEpiCs)의 구매와 배양은 저자들이 이미 보고한 선행연구³⁰⁾ 방법과 동일하게 하 였다. ScienCell Research Labortorie(HCEpiCs, U Cat. No. 6510, USA)에서 HCEpiCs를 구매하여 사용 하였고, 계대 및 유지에는 세포 구매사에서 제시한 방 법과 배양액(CEpiCM, Cat. No. 6511, USA)을 사용하 였다. 세포는 5% CO₂, 37℃의 조건으로 세포배양기 (CO₂ Cell Culture Incubator, MCO-5AC^TM, Panasonic, USA)를 이용하여 배양한 후 실험에 사용하였다.

배양용기(NuncEasy FLASK 75cm² NunclonDeltasurface, Cat, N. 156499, ThermoScientific, USA) 바닥면적 에 70%의 밀도로 각막상피세포가 자라면, 0.05%의 Trypsin-EDTA(Gibco, Cat, N. 25399-1²⁰⁾를 첨가 하여 상피세포를 배양용기 바닥면에서 분리하고, 분리 된 모든 세포 중 10%는 새로운 배양용기로 옮겨 유지 하고 나머지 세포들은 실험에 사용하거나 폐기하였다.

2) PHMB, EGCG 및 PHMB/EGCG 혼합물 농도

실험에 사용한 PHMB(Rotor, KOREA)와 EGCG(50299 FLUKA, SIGMA-ALDRICH, USA) 용액은 저자들이 이미 보고한 선행연구²⁵⁾ 방법과 동일하게 하였다. 순도 80%의 분말형태로 정제된 PHMB는 생리식염수에 녹여 0.01% 농도로 희석하여 1 ㎖ 씩 분주한 후 5℃에서 냉 장 보관하여 사용하였고, EGCG는 Sigma-Aldrich에서 판매되고 있는 순도 80%의 분말형태로 정제된 시약 을 구입하여 사용하였으며, 생리식염수에 디메틸 술 폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 0.2%를 희석한 후 EGCG의 최종농도가 0.3%가 되게 희석하여 1 ㎖씩 분주한 후 –20℃에서 냉동보관하여 사용하였다. EGCG 는 시약준비과정 및 실험과정에서 차광상태를 유지하 여 빛에 노출되지 않도록 주의하였다. PHMB와 EGCG 의 각막상피세포 독성을 확인하기 위해서는 PHMB는 0.00001~0.005%의 농도로, EGCG는 0.001~5%의 농 도로 용액을 만들어 사용하였으며, PHMB/EGCG 혼 합물의 세포독성을 확인하기 위해서 선행연구결과²⁵⁾를 바탕으로 ISO에서 규정한 세균과 진균에 충분한 항균효 과를 보이는 최소저해농도(PHMB는 0.00005%, EGCG 는 0.05%)를 사용하였다.

2. 연구방법

1) 각막상피세포 독성 확인을 위한 PHMB와 EGCG 용액 처리

각막상피세포의 독성을 확인하기 위한 실험도 저자 들이 이미 보고한 선행연구²⁵⁾ 방법과 동일하게 하였 다. 배양된 각막상피세포를 384 well plate(384 well plate, Cat, N. 788091, Greiner Bio-one, Germany) 에 일정한 수만큼 옮기고 세포 안정화를 위하여 24시간 배양한 후 사용하였다. 각막상피세포의 배양액에 PHMB는 0.00001~0.005%의 농도로, EGCG는 0.001~5%의 농도 단독 화합물 용액으로 제조하였고, PHMB/EGCG 혼합물 의 세포독성을 확인하기 위해서는 PHMB와 EGCG 농도가 각각 0.00005%, 0.05%이 되도록 제조하여 넣어주고 배양하였다. 실제 콘택트렌즈를 착용하는 경우 다목 적용액이 콘택트렌즈 표면에 묻어서 결막이나 각막부 위에 닿는 양은 최소 10 μL에서 최대 100 μL로 매 우 적고, 안구에서 일어나는 눈물의 순환, 각막표면 의 생물학적인 특성을 고려할 때 15~30분의 처리시 간이 실제 안구에 미치는 시간이라 볼 수 있다.^31,32) 본 연구에서는 세포독성을 관찰하기 위해서는 방부제 가 포함된 용액에서 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 12 시간, 24시간 동안 배양하고 세포독성을 관찰하였고, 매 실험마다 항생물질을 처리하지 않은 대조군을 추 가하여 진행하였다. 대조군은 세포배양액과 인산완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 PHMB 및 EGCG 용액과 동일한 양 만큼 사용하였다.

2) 각막상피세포의 이미지 분석을 위한 처리 및 분석방법

각막상피세포의 이미지 분석 방법도 선행연구³⁰⁾ 방 법과 동일하게 진행하였다. PHMB 및 EGCG 용액을 처리한 각막상피세포는 4%의 파라포름알데히드용액 (paraformaldehyde solution in 4% in PBS, Cat, N. 199431LT, Affymetrix, USA)으로 10분간 고정 시키고, Draq5^TM(1,5-bis{[2-(di-methylaminoethyl] amino}-4,8-dihydroxyanthracene-9,10-dio, CellSignalTechnology, Cat,N #4084, USA)를 사용 하여 세포핵 내에 존재하는 DNA를 염색하였다. Draq 5로 염색된 실험군과 대조군의 각막상피세포는 공초 점현미경(confocal microscopy, Axiovert 200M^TM, CarlZeiss, Germany)과 ImageXpress Ultra^TM (autoconfocal high content-screening system, Molecular Devise, USA)를 이용하여 관찰하고 세포의 사진을 저장한 후 MetaXpress^TM(Molecular Devise, version 2.0.0.13, USA) 프로그램를 이용하여 분석하였다.

세포독성을 받은 각막세포를 구별하기 위하여 선 행연구³⁰⁾와 동일한 방법으로 정상세포와 손상된 세포 및 자살형태를 보이는 세포의 형태적 특징(세포와 핵 의 크기 및 염색된 세포핵의 형광 밝기)을 수치화한 기준에 따라 구별하였고, 세포독성은 세포 생존율 백 분율로 계산하였다. 대조군과 실험군의 각막상피세포 는 반응시간이 길어지면 세포증식이 일어나 세포 수 가 증가하기 때문에 실험군의 생존율은 각각의 처리 시간별로 대조군의 세포수를 기준으로 계산하여 백분 위로 표시하였고, 분석은 상위 10% 및 하위 10% 값 을 제외한 나머지 80%의 평균값을 기준으로 하였다.

3) 통계분석

실험군의 그룹 간 유의성은 측정값을 일원분산분석 (One-way ANOVA)과 이원분산분석(Two-way ANOVA) 법을 이용하여 분석하였고, 통계분석은 PRISM(GraphPad PRISM, Version 5.01, GraphPad Software, USA) 프로그램을 이용하였으며, p 값이 0.05 미만인 경우 를 유의한 차이가 있는 것으로 판단하였다. (Fig. 1).

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. PHMB의 각막상피세포 독성 평가

각막상피세포를 0.00001~0.005%의 PHMB가 포 함된 배양액에 넣고 반응시킨 후 2, 12, 24, 48 시간 동안 배양한 결과를 중심으로 분석하였다. 고농도의 (0.005% 및 0.001%) PHMB 용액에서는 시간이 경과 함에 따라 각막상피세포의 수가 감소하였지만 낮은 농도(0.0005% 이하)에서는 시간이 경과해도 각막상 피세포 수는 증가하였고 0.00005%의 농도에서는 대 조군과 유사한 수준으로 증가하였다. 따라서 PHMB 의 경우 0.0005% 이하의 농도에서는 각막상피세포에 미치는 독성이 없지만 그 이상의 농도에서는 세포독 성이 있는 것으로 나타났다(Fig. 2).

PHMB의 경우 저항력이 높은 그람음성균과 진균에 대해서도 높은 살균효과를 보이며 특히 녹농균에 강력 한 살균효과를 보인다고 보고되어 콘택트렌즈용 다목적 용액에 가장 흔하게 사용되고 있는 항균제이다.^11,12) 황 색포도상구균, 메티실린내성 황색포도상구균, 녹농균, 세라티아 마르세센스 균에 대한 PHMB의 최소저해농도 는 각각 0.0002%, 0.0004%, 0.00025%, 0.00025%이 며, 진균인 칸디다 알비캔스와 푸사리움 솔라니에 대 한 최소저해농도는 각각 0.00025%, 0.0002%로 매우 낮은 농도에서도 우수한 항균작용을 보인다고 보고되 었다.²³⁾ 또한 가시아메바에 대한 살균효과도 다른 항 균제에 비하여 탁월한 것으로 밝혀져²³⁾ 콘택트렌즈용 관리용액에 광범위하게 사용되고 있다.³³⁾

그러나 PHMB는 세포 내 미토콘트리아에 독성을 유발하고³⁴⁾ 각막실질세포의 생존률을 저하시킨다고 보고되었고,³⁵⁾ 각막과 결막에 자극감을 유발하는 것으 로 알려져 있다.¹³⁾ 다목적용액의 안구 내 독성 연구는 콘택트렌즈 표면에 결합된 다목적용액에 의해 나타나 는 독성효과^27,32,36)와 콘택트렌즈 내부로 침투된 관리 용액 성분이 눈물로 서서히 방출되어3^7,38) 나타나는 독 성효과를 고려해야 한다. PHMB 계열(polyhexanide, Dymed, polyaminopropyl biguanide)의 화합물은 FDA 4 그룹(이온성, 고함수)에 해당하는 콘택트렌즈 재질에는 상당량이 흡수되어 눈물로 방출된다고 보고 되었다.³⁹⁾ 본 연구결과 0.001% 이상의 PHMB 농도에 서는 각막상피세포독성이 관찰되었지만 0.005% 이하 의 농도에서는 세포독성이 없는 것으로 확인되었고, 0.0005% 이하에서 48시간 반응시킨 후에도 세포 독성 이 없는 것으로 나타났다. 따라서 관리용액 제품에 사 용되는 0.00005% PHMB 농도에서는 PHMB가 콘택트 렌즈 재질내부로 흡수된 후 눈물로 용출되어 나타나는 각막상피세포 독성은 희박할 것으로 생각된다.

2. EGCG의 각막상피세포 독성 평가

각막상피세포를 0.001~5%의 EGCG가 포함된 배양 액에 넣고 2, 12, 24, 48 시간 동안 배양한 결과 고농 도의(5%) EGCG 용액에서는 시간이 경과함에 따라 각 막상피세포 수가 감소한 반면, 1% 이하의 농도에서는 시간이 경과해도 각막상피세포 수는 증가하였고, 0.05% 이하의 농도에서는 대조군과 유사한 수준으로 증가하 였다(Fig. 3). 따라서 EGCG의 경우 0.05% 이하의 농 도에서는 각막상피세포에 미치는 독성이 없지만 그 이상의 농도에서는 세포독성이 있는 것으로 생각된다.

천연 항균물질인 EGCG는 천연식품 성분으로 안전 한 물질이지만, 고농도에서도 칸디다 알비캔스에 항 균효과가 나타나지 않으며 녹농균과 세라티아 마르세 센스균, 진균인 칸디다 알비캔스 및 푸사리움 솔라니 에 대한 최소저해농도가 각각 0.2%, 0.3%, 0.3% 이 상, 0.3%로 ISO 규정 안질환 균주에 대한 최소저해 농도가 PHMB보다 약 100~1,500배 높은 것으로 보 고되었다.²³⁾ 따라서 충분한 살균효과를 갖기 위해서는 고농도로 사용해야 하는데 본 연구에서는 5% EGCG 농도에서 시간이 경과함에 따라 각막상피세포 수가 감소하였으며, 1% 이하의 농도에서는 세포 독성이 없 었고, 0.05% 이하의 농도에서는 대조군과 유사한 수 준으로 나타났다. 따라서 EGCG가 각막상피세포에 미 치는 독성은 다른 방부제에 비해 적으며, 관리용액에 0.05% 이하의 농도로 사용된다면 각막상피세포에 미 치는 독성은 미미할 것으로 사료된다.

3. PHMB와 EGCG 혼합물의 각막상피세포 독성 평가

ISO에서 규정한 세균과 진균에 충분한 항균효과를 보이는 PHMB/EGCG 혼합물의 농도는 각 화합물의 최 소저해농도(PHMB는 0.00005%, EGCG는 0.05%)보다 낮지만²³⁾ 본 연구에서는 PHMB와 EGCG의 최소저해농 도로 PHMB/EGCG 혼합물을 만들고 동일한 조건에서 분석하기 위해 동일한 농도의 PHMB(0.00005%)와 EGCG(0.05%) 용액도 함께 평가하였다. PHMB(0.00005%), EGCG(0.05%) 및 PHMB/EGCG(0.00005%/0.05%) 혼 합액을 넣은 배양액에서 30분, 1시간, 2시간 및 4시간 각 막상피세포를 배양하고 분석한 결과 30분, 1, 2, 4시간 동안 처리한 경우에는 각막상피세포 수가 대조군과 유 의한 차이가 없었고(p>0.05), (Fig. 4), 생존세포(survival cell)의 수도 차이가 없었다(Fig. 5). 그러나 전체세포 중 손상된 세포의 비율은 0.05% EGCG와 PHMB/EGCG (0.00005%/0.05%) 혼합액에서 4시간 배양한 경우에 증가하는 것으로 나타나 만성독성에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다(Table 1).

PHMB/EGCG 혼합물의 경우 0.00005%/0.05%의 PHMB/EGCG 혼합물은 4 종류의 세균(황색포도상구 균, 메티실린내성 황색포도상구균, 녹농균, 세라티아 마르세센스)과 2 종류의 진균(칸디다 알비캔스, 푸사리 움 솔라니), 총 6개의 ISO 규정 균주에 대하여 모두 충 분한 항균효과를 나타내었고 EGCG를 첨가함에 따라 다목적용액에 포함된 PHMB 농도를 1/4 수준으로 낮추는 효과가 있었다.²³⁾ 본 연구를 통하여 0.00005%/0.05% PHBM/EGCG 혼합물에 1시간, 2시간 처리한 경우에 는 각막상피세포에 손상을 주지 않는 것으로 나타나 EGCG가 PHMB의 탁월한 항균효과를 유지하면서 각막 상피세포 독성을 낮춰주는 항균보조제로 역할을 할 수 있음을 확인하였다. 그러나 4시간 배양한 경우에 손상 된 세포의 비율이 증가하는 것으로 나타나 만성독성에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 또한 EGCG는 제품화되기에는 가격적인 면에서 경제성이 낮 은 이유로 아직 활용되기에는 제한점이 있으며, 시간이 경과하면서 역가(titer)가 떨어지는 문제점이 있는지에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

Ⅳ. 결 론

각막상피세포 배양 모델을 이용하여 PHMB, EGCG 및 PHMB/EGCG 혼합물이 각막상피세포에 미치는 급성 독성을 확인한 결과, PHMB는 0.00005% 이하의 농도에서, EGCG는 0.05% 이하의 농도에서 각막상피 세포 독성이 없었고, 0.00005% PHMB/0.05% EGCG 혼합물에서 각막상피세포독성이 없는 것으로 나타났 다. 그러나 PHMB/EGCG 혼합물의 경우 배양 시간이 길어지면서 손상된 세포의 비율이 증가하는 것으로 나타나 만성독성에 대한 추가적인 연구가 필요할 것 으로 사료된다.