Ⅰ. 서 론

저출력 레이저 치료(low level laser therapy, LLLT) 로 알려진 Photobiomodulation(PBM)은 630~1000 nm 파장의 적색 또는 근적외선(red/near-infrared light)을 조사하여 세포의 기능을 조절함으로써 생리적 치 유를 유도하는 광치료 기술이다.¹⁾ 세포내 미토콘드리아 (mitochondria)에 존재하는 산화효소인 cytochrome c oxidase(CCO)는 적색 또는 근적외선에 대한 광수용기 (photoreceptor) 역할을 하는 것으로 알려져 왔으며, 600~850 nm 빛의 50% 이상을 흡수할 수 있는 것으로 보고되었다.^2,3) 광원의 광자(photon)에 의해 활성화된 CCO는 직접적으로 미토콘드리아의 호흡(mitochondrial respiration)을 자극하고, 간접적으로 산화질소(nitric oxide, NO)를 CCO로부터 분리시킨다.⁴⁾ 이 과정에서 ATP(adenosine triphosphate), cAMP(cyclic adenosine monphosphate), ROS(reactive oxygen species), Ca⁺ 이 증가되고 미토콘드리아로부터 방출되어 각각의 해당 세포 내신호전달(intracellular signaling pathway)을 통해 항 산화물질(antioxidants), 항염증작용(anti-inflammatory processes), 세포사멸억제단백질(anti-apoptotic proteins), 세포 증식(proliferation) 및 이동(migration)과 관련된 유전자들의 발현을 조절한다.^3,5,6)

PBM은 뇌, 뼈, 내장, 결합 조직, 피부, 근육 조직을 대상으로 한 임상연구에서 통증 및 염증 완화, 창상치유 에 대한 임상적 효과가 보고되었다.⁷⁾ 망막질환을 대상으로 한 임상연구에서는 당뇨망막증(diabetic retinopathy, DR), 연령관련황반변성(age-related macular degeneration, AMD), 망막색소변성증(retinis pigmentosa, RP) 환자 에 780 nm의 PBM을 적용한 후 이들 질환의 억제 효과 를 보고하였다.⁸⁾ 연구에 따르면 PMB 치료는 망막 염증, 신경세포죽음을 유의미하게 완화시키며.⁹⁾ 손상된 망막 내 ROS를 감소시킨다고 하였다.¹⁰⁾ 최근 동물모델을 이 용한 연구에서 PBM은 정상세포에서 ROS를 증가시키지 만, 산화스트레스 상태에서는 ROS를 감소시키는 것으 로 보고하였다.¹¹⁾

PBM의 광원은 주로 레이저가 사용되어져 왔다. 최근 보고에 의하면 현재까지 3,500편이 넘는 PBM에 관한 연구결과가 출판되었으며, 이 중 약 85~90%는 레이저 를 광원으로 사용했다.¹²⁾ 특히, 2010년까지는 모든 연 구와 상용화된 PBM 치료기기에서 레이저를 사용하였 다. 그러나 최근 몇 년 사이 경제성과 제작 및 사용 편의 성 측면에서 장점인 LED(light-emitting diode)의 사 용이 늘어나고 있으며,¹³⁾ 피부 창상치유, 급성통증과 만 성통증 완화, 손상 척추의 신경재생에 대한 LED 기반의 PBM의 유효성을 입증하는 기초 및 임상연구결과 또한 상당 수 보고되고 있다.^14,15) 그러나, 망막질환에서 LED 기반의 PBM 연구는 매우 부족한 실정이다. 본 연구에 서는 670 nm의 LED 장치를 제작하고, 이를 AMD 동물 모델에 적용하여 망막신경세포의 퇴화를 억제할 수 있는 지를 알아보고자 하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 망막신경퇴화 동물모델 제작과 670 nm LED 조사

출생 8주령 수컷 C57BL/6J 마우스(Jackson Laboratory)를 사용하였으며, 모든 동물과 관련된 실험 은 건양대학교의 동물실험윤리위원회(IACUC)의 승인 (번호:P-15-15-E-01)과 함께 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology)의 동물 실험 절차 및 준수사항에 따라 시행되었다. 마우스는 12 시간 동안은 5 lx의 조명에서 12시간은 암실에서 길러졌 다. 사료와 물은 자율 배식했다. 망막신경퇴화 유도하기 위해 생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)에 희석된 NaIO₃를 40 mg/kg 농도로 복강주사를 통해 주 입 후 6일 뒤 확인하였다. 실험 그룹은 4개의 그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. 첫 번째 ‘PBS’ 그룹은 PBS 가 주입되었고 670 nm 빛을 조사하지 않았고, 두 번째 ‘NaIO₃’ 그룹은 NaIO₃이 주입된 후 670 nm 빛을 조사 하지 않았다. 세 번째 ‘PBS+light’ 그룹은 PBS 주입 후 670 nm 빛을 조사하였고, 네 번째 ‘NaIO₃+light’그룹 은 NaIO₃ 주입 후 670 nm 빛을 조사하였다.

2. 670 nm LED 조사장치 제작 및 적용

LED 기반의 빛 조사장치는 670 nm LED패널(Thorlab Inc, NJ, USA), 반도체 냉각장치(semiconductorcooling unit, Thorlab Inc, NJ, USA), 빛세기 제어기 (light intensity controller, Thorlab Inc, NJ, USA), 마우스케이지로 구성되었다. 분광광도계(spectrometer, SPIC-200BW, KIS Instrument, Seoul, Korea)를 사 용하여 광원의 스펙트럼, 최고파장, 노출세기를 측정 하였다. 마우스에 빛을 조사하기 위해 암실에서 각막 (cornea)에 Atropine Eye Drops(Alcon, Puurs, Belgium)을 한 방울 떨어뜨려 암실에서 10분 동안 동공 을 확대시킨 후 케이지에 놓인 마우스를 60 mW/cm² 출력에서 1시간 간격으로 2분 동안 하루에 3회 노출시 켰다.

3. 면역형광염색과 TUNEL 분석

마우스의 안구를 적출한 후 고정액(4% paraformaldehyde, Wako, Japan)에 4℃에서 12시간 고정 후, 30% sucrose(in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4)용액에 넣어 조직이 가라앉을 때까지(18~24시간) 침투시켰다. 안구조직은 OCT compound(Sakura, Torrance, USA) 를 사용하여 동결 후, 10 μm 두께로 동결절편(frozen section) 하였다. 조직절편들은 PBS로 수세하고, 고정액 에 5분 동안 재고정한 후 0.1% Triton X-100(Sigma, St. Louis, USA)에 넣어 permeabilization 시켰다. Blocking을 위해 1% BSA, 2.5% normal goat serum, 2.5% normal donkey serum가 희석되어 있는 PBS에 1시간 동안 넣어둔 후 일차항체(primary antibody) 를 12~16시간 동안 반응시켰다. 일차항체는 rabbit polyclonal anti-GFAP, Opsin, Vimentin(Millipore, Middlesex County, USA)와 mouse monoclonal anti-Rhodopsin이 사용되었다. 조직절편들을 수세한 후 이차항체(secondary antibody) goat anti-rabbit, mouse Alexa 488(Invitrogen, Middlesex County, USA), goat anti-rabbit, mouse Cy3(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, USA) 에 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 Hoechst33258 (Sigma, St. Louis, USA)으로 counterstaining을 하 고 PBS로 수세 후 coverslip을 덮은 뒤 형광현미경 (Imager D2, Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용 하여 관찰, 촬영하였다. 촬영된 이미지는 Zen blue edition(Zen, Zeiss, Oberkochen, Germany) 프로그 램을 사용하여 분석하였다.

세포사멸 분석은 TUNEL(Tdt-mediated dUTP Nick-End Labelling) 염색법을 이용하였다. NaIO₃ 주 사 후 3일차에 망막으로부터 얻어진 동결절편 조직들을 수세 후, in situ cell death detection kit(Roche, Basel, Swiss)를 사용하여 해당 사용법에 따라 실행되 었다.

4. 망막 바깥핵층(outer nuclear layer, ONL) 두께 분석

망막 ONL의 두께를 분석하기 위해 NaIO₃ 주사 후 6일차에 망막은 고정되었다. 망막 조직절편들은 Hoechst33258을 사용하여 세포핵을 염색하고 촬영하였 다. 촬영 된 망막 이미지에서 ONL 두께는 시신경유두 (optic disc)을 중심으로 코쪽(nasal)과 귀쪽(temporal) 방향으로 300 μM 간격으로 측정되었다. 망막 ONL의 두 께를 분석을 위해 그룹 당 4마리의 마우스가 사용되었다.

5. 유전자 발현 분석

마우스에서 망막조직을 분리한 후 Trizol reagent (Invitrogen, USA)을 사용하여 RNA(total RNA)를 추 출하였다. cDNA(complementary DNA)는 total RNA 2 μg과 Superscript II(Invitrogen)를 사용하여 합성되 었다. 유전자 발현 분석은 실시간유전자증폭(real-time PCR) 방법을 이용하였다. 합성된 cDNA는 SYBR Green mix(Bio-rad, Contra Costa County, USA), primer 쌍 을 혼합한 후 Bio-Rad CFX10 detection system에서 증폭하였다. 유전자 발현 양은 GAPDH의 발현 양으로 정 규화(normalization)하여 분석하였다. TNFα 유전자에 대한 primer 쌍은 5’-TATGTC CAGCCTCTTCTCA-3‘(F) 와 5’-GTTGTCTTTGAGATCCATGC-3’(R), IL-1β 유전자는 5‘-AAGGAGAACCAAGCAACGAC-3’(F)와 5’-TGGGGAACTCTGCAGACTCAA-3’(R), GAPDH 유전자는 5‘-ACGGCAAATTCAACGGCACAG-3’(F) 와 5‘-GGTCATGAGCCCTTCCACAA-3’(R)의 염기서 열로 합성하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 670 nm PBM에 의한 광수용세포의 손상억제

제작된 LED 기반 조사장치(Fig. 1 A)의 빛 스펙트럼 은 630~690 nm, 최고파장은 667 nm로 나타났다(Fig. 1 A, B). 이 결과는 670 nm LED의 성능상 유효범위 내에 있음을 의미한다. 670 nm LED PBM의 망막퇴화 (retinal degeneration) 억제효과를 분석하기 위해 NaIO₃ 를 마우스에 복강주사하여 망막손상(retinal injury)을 유도하였다. NaIO₃는 망막색소상피(retinal pigment epithelium)의 선택적 손상을 야기하여 광수용세포 (photoreceptors)의 사멸을 일으키는 산화제로 알려져 있다. NaIO₃ 주사 후 6일차에 Hoechst에 염색된 망막 에서 불규칙한 ONL 구조가 관찰되었다(Fig. 1 C). ONL의 두께를 측정한 결과 NaIO₃가 주입된 망막 (NaIO₃ 그룹)의 ONL 두께는 PBS를 주사한 대조군 (PBS 그룹)과 비교해서 유의적으로 감소하였다(Fig. 1 D). NaIO₃ 주사 후 1일차부터 1시간 간격으로 하루에 3회 2분 동안 670 nm LED 빛에 노출되어진 NaIO₃+light 그룹에서 ONL의 층 구조는 PBS 그룹 또 는 PBS 주사 후 빛을 조사한 PBS+light 그룹과 유사하 게 관찰되었으며(Fig. 1 C), ONL의 두께는 NaIO₃ 그룹 과 비교하여 유의적으로 보다 두꺼운 수치를 나타냈다 (Fig. 1 D).

망막신경퇴화 과정동안 망막의 바깥핵층(ONL) 두께 의 감소는 광수용세포의 사멸에 의해 일어난다. 670 nm PBM이 광수용세포의 사멸을 억제하는지 확인하기 위해 TUNEL 염색 분석을 시행하였다. 예상한 것처럼 NaIO₃ 그룹과 NaIO₃+light 그룹에서 TUNEL 염색된 세포가 ONL에서 관찰되었다(Fig. 2 A). 두 그룹 사이 TUNEL 염색된 세포 수의 비교 분석하였을 때 NaIO₃+light 그 룹에서 유의한 수적 감소를 확인하였다(Fig. 2 B).

2. 670 nm PBM에 의한 광수용 단백질과 염증성 사이토카인 유전자의 발현 변화

Rodopsin, S-opsin, L/M-opsin은 광수용세포의 바깥절(outer segment)에 존재하는 광수용 기능 단백 질이다. 670 nm PBM에 의한 광수용세포 기능손상 억제효과의 가능성을 분자수준에서 확인하기 위해 Rodopsin, S-opsin, L/M-opsin 항체를 사용하여 면 역형광염색을 통해 이들 단백질 발현을 분석하였다. NaIO₃ 그룹에서 Rodopsin, S-opsin, L/M-opsin의 형광염색세기는 PBS 그룹 또는 NaIO₃+light 그룹 보다 감소하였다. NaIO₃ 그룹과 비교한 NaIO₃+light 그룹에 서 이들 형광염색세기가 증가하는 것으로 확인되었다 (Fig. 3 A). 비록 NaIO₃+light 그룹에서 Rodopsin 단 백질의 발현은 증가하였지만 비정상적인 바깥절의 구조 가 관찰되었다. 광수용세포의 손상은 염증성 사이토카인 (inflammatory cytokine)을 증가시킨다. 실시간유전자 증폭분석 결과 염증성 사이토카인 IL-1β와 TNFα 유전 자 발현이 NaIO₃ 그룹과 비교한 NaIO₃+light 그룹에서 유의하게 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 3 B).

3. 670 nm PBM에 의한 뮐러세포의 손상반응 억제

망막신경 보호기능을 하는 뮐러세포(Muller glia)는 망막손상에 대한 초기 반응으로 GFAP와 Vimentin 단 백질을 발현시킨다. 670 nm PBM이 뮐러세포에 영향을 주는지 확인하기 위해 망막 조직절편들을 GFAP와 Vimentin 항체를 사용한 면역형광염색을 통해 분석하 였다. NaIO₃ 주입 후 망막을 670 nm 빛으로 하루3번 2 분씩 4일동안 치료하였다. 뮐러세포의 GFAP, Vimentin 단백질의 발현은 PBS 그룹과 PBS+light 그룹에서 관 찰되지 않았으나, NaIO₃ 그룹에서 망막전층에 걸쳐 관 찰되었다(Fig. 4 A, B). NaIO₃+light 그룹에서는 이들 단백질의 발현이 현저히 감소하였다.

Ⅳ. 고 찰

LED 기술이 발전하면서 PBM에 사용되는 광원은 레 이저에서 LED로 대체되고 있으며, LED PBM과 레이저 PBM의 효과가 유사하다는 것이 환자, 동물, 세포를 대 상으로 한 연구에서 입증되고 있다.¹⁶⁾ 이들 연구에서 사 용된 LED 광원의 파장은 PBM을 적용하는 세포 또는 조직에 따라 630~950 nm로 다양했다. 본 연구에서는 670 nm PBM이 망막신경퇴화를 억제할 수 있다는 것을 보고한다.

NaIO₃에 의한 망막퇴화 동물모델에서 670 nm LED 의 조사(NaIO₃+light 그룹)는 망막의 ONL 층 두께 감 소를 억제하였다. ONL는 광수용세포의 세포체(cell body, soma)로 구성되어있기 때문에 ONL의 두께 감소는 광 수용세포의 소실로 인해 나타나는 구조적 변화를 의미한 다. TUNEL 염색을 통해 세포사멸을 분석한 결과에서 TUNEL 염색은 ONL을 구성하는 세포핵에서 관찰되었 다. 670 nm LED 조사는 TUNEL 염색된 사멸세포의 수를 현저히 감소시켰다. 이들 결과들은 670 nm PBM 은 광수용세포의 손상에 대한 보호작용을 통해 망막 의 구조 변화를 억제한다는 것을 제시한다. 광전화 (photransduction) 과정에 핵심인 광수용단백질 Rhodopsin, Opsin은 광수용세포의 바깥절에서 우세하 게 발현된다.¹⁷⁾ NaIO₃에 의해 유발된 손상망막에 670 nm LED 빛의 조사는 Rhodopsin, S-Opsin, L/M-Opsin의 발현을 빛에 노출되지 않은 망막 보다 증가시켰다(NaIO₃+light 그룹 vs. NaIO₃ 그룹). 그러 나 Rhodopsin에 대해 면역형광염색된 막대세포(rod cells)의 바깥절은 비정상적으로 불규칙한 형태를 보였 다. 따라서 670 nm PBM은 막대세포보다는 원뿔세포 (cone cells) 보호작용에 특이적으로 작용할 수 있다.

660, 780 nm 레이저 PBM을 적용한 여러 조직에서 염증성 사이토카인들을 감소시키는 염증완화효과가 보 고되었다.^18,19) IL-1β와 TNFα는 대표적인 염증성 사이 토카인이다.²⁰⁾ NaIO₃ 유발 손상망막에서 670 nm LED PBM 적용은 IL-1β와 TNFα 유전자 발현을 증가시켰 다. TNFα는 세포내 ROS를 생성하고, IL-1β는 미토콘 드리아 기능장애와 세포내 ROS 양을 증가시킨다. 증가 된 ROS는 세포사멸을 유도한다.²¹⁾ 비록 670 nm LED PBM에 의한 ROS 생산조절은 추가적 연구가 요구되나, 이들 결과들은 670 nm의 PBM은 손상망막에서 염증성 사이토카인을 감소시켜 광수용세포를 사멸로부터 보호 할 수 있음을 제시한다.

망막에서 IL-1β와 TNFα 생성의 주요 세포는 뮐러세 포다. 최근 연구에서 일차 배양한 뮐러세포에 670 nm LED를 조사하였을 때 IL-1β가 증가함을 보여주었다. 뮐러세포는 망막에서만 관찰되는 특화된 신경아교세포 로 속경계막(inner limiting membrane)과 바깥경계막 (outer limiting membrane) 사이 방사상으로 뻗어있 는 구조를 보여준다. 이들 세포는 손상에 대한 자극으로 반응성 신경교증(reactive gliosis)를 겪는다.²²⁾ 이 과정 이 지속적으로 진행되면 망막상흔(retinal scar)을 야기 한다. GFAP와 Vimentin은 반응성 신경교증의 표시인 자로 신경조직의 손상 시 이들 단백질이 발현된다.^23,24) NaIO₃ 유발 손상망막에 670 nm LED 조사는 GFAP와 Vimentin 발현을 감소시켰다. 또한 우리는 손상 자극이 없는 망막에 670 nm LED 빛을 조사(PBS+light 그룹) 하였을 때 뮐러세포에서 GFAP와 Vimentin 발현은 나 타나지 않음을 확인하였다. 이 결과들은 670 nm LED PBM은 망막에 자극 없이 보호작용을 유도한다는 것을 의미한다.

Ⅴ. 결 론

PBM 요법은 빛의 높은 조직 침투율을 이용한 비침습적 인 치료기술이다.²⁵⁾ 우리의 연구결과들은 670 nm LED 를 이용한 PBM은 망막 광수용세포의 퇴화를 손상자극 없 이 효과적으로 억제할 수 있음을 제시한다. 연령관련황반 변성은 산화스트레스에 의한 망막색소상피의 손상과 이로 인한 광수용세포의 사멸에 의해 유발되는 것으로 알려져 있으며, 망막색소상피의 지도모양위축(geographic atrophy) 특징이 관찰된다.²⁶⁾ NaIO₃가 주입된 망막은 연령관련황반변성 환자에서 관찰되는 특징을 모사하는 질 환모델로 널리 사용되고 있다.²⁵⁾ 따라서 본 연구결과는 670 nm LED를 이용한 PBM은 연령관련황반변성 치료기 술 개발에 새로운 전략을 제공할 것이다.